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基因测序的基础 一代测序 桑格测序与 NGS, 转录组, 单细胞测序singal cell sequencing, RNA基础, 实验组 对照组 …
基因测序的基础 一代测序 桑格测序与 NGS
tranditional sequencing
人类基因组计划
完成于2001
降低了人类基因组成本
刺激了廉价基因测序技术发展
使用传统的桑格测序法 sanger sequencing
dna 原理
AT CG
DNA 是双链分子 可以变性 分解为单链 重新组合起来 添加不同的序列
DNA可以被聚合酶复制 可以将dna和基本的DNA组成部分聚合
三磷酸基团 使其他的脱氧核糖核苷酸结合在上面
3羟基 用来添加额外的脱氧核糖核苷酸
四个不同的碱基
桑格测序法
使用荧光终止子不再添加传统的dna碱基不让聚合酶延长DNA分子
荧光终止子 和传统的DNA非常相似结构
3羟基脱氧核糖核酸 用来扩增dna被终止 因此被叫做荧光终止
在试管中放入正常的dNTP（脱氧核糖核酸）然后加入低浓度的荧光终止子（Ddntp）然后得到一堆碎片 新和成的不同大小的dna 然后放到DNA测序器然后把他们分开测序
在测序器上分子从小到大被检测到 然后从测序器中得到的痕迹 就是一张色谱图 随着颜色的变化即可建立自己的DNA序列
第一 变性 第二添加引物 使得DNA聚合酶可以结合
一次最多允许384样品生成 700个碱基的序列 人体大约有60亿对碱基
一次运行对比 illumina
mi seq 30millon
HI seq 3billon
Novaseq 13billon
sangar 4hundreds
illumina 一次读取300-600个碱基的序列错误率是千分之一
illumina SEQ
簇生成
测序
样本准备
数据分析
后来发展出高通量的方法，主要是给每个细胞加上独一无二的DNA序列（就是条形码barcode，就是为了识别），然后测序时将相同的barcode序列归为同一个细胞来源
单细胞转录组可以在polyT引物5'端加上barcode；单细胞基因组目前主要利用高效转座酶（transposase）Tn5实现
转录组
数据分析
rpkm/fpkm
RPKM=
对采集到的信息进一步进行数据分析从而对基因的表达量进行衡量
样品准备 因为是通过将实验组和对照组进行对比来发掘基因功能，因此至少准备两组材料 实验组以及对照组
为了降低材料的特异性带来的差异 因此需要重复
转录组的检测对象为RNA，rna受到Rrase的催化而降解，因此需要小心操作。
数据采集
测序和基因芯片
测序是通过测定所有的RNA序列和数量来衡量基因表达水平
二代测序的理念都是把大片的打成小片的进行测序，然后根据序列信息进行拼接
基因芯片通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
第一代测序昂贵 通量低
转录组测序的最终数据为所有基因的表达量，因此只要能实现该目标的方法均被称为转录组分析
A 以dna为模板，rna聚合酶转录出DNA B rna从细胞核中进入细胞质 C以rna为信息核糖体翻译出氨基酸序列 D氨基酸序列折叠成蛋白质表达功能
基因的转录（表达）对个体有至关重要的作用
转录组是某一个体/组织/细胞在某一时间状态下的转所有基因的表达情况进行检测的结果，通过与对照进行对比 发掘在某一特定条件下行使功能的特定基因
单细胞测序singal cell sequencing
肿瘤 tumor
单细胞RNA-seq能够独立地提供每个细胞的RNA表达谱，并鉴定异质细胞群中的稀有细胞。尽管肿瘤异质性可归因于累积突变，但即使是遗传上相同的细胞在相同环境下也可能表现出基因和蛋白表达水平的差异，从而导致耐药性的产生。单细胞RNA-seq就能够发现这些稀有个体。
第一步 单细胞分离
若对通量要求不高，可选择在显微镜下手动挑选细胞，或采用激光捕获显微切割（LCM），这些是基于细胞形态或荧光报告基因表达的有偏向选择，好处在于您可以了解单细胞所处的环境和它们以前的邻居，缺点是您需要特别小心，以免切到细胞或细胞核。相比之下，细胞的有限稀释就是无偏向的。
异质性的细胞群体中分离单细胞 选择分离方法时，您可能需要考虑它是高通量还是低通量，以及是盲选还是有偏向的选择（基于某个参数）。一些高通量的技术，比如最常用的荧光激活细胞分选（FACS）和磁性激活细胞分选（MACS），可根据细胞的大小/形状或细胞表面标志物的表达进行有偏向的选择，而基于微流体和液滴的技术可实现细胞的无偏向分离，如Fluidigm C1和10x Genomics Chromium系统（微流体）以及Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator（液滴）。不过，需要注意的是，组织/细胞的解离过程可能会改变RNA的表达谱。
基于标签（barcode）的单细胞识别。它的核心思想是：在对每个细胞的mRNA测序前做逆转录时，为其加上独一无二的标签序列。这样即便是混合起来测序，我们也可以把携带相同标签序列（barcode）的RNA片段视为来自同一个细胞。通过这种策略，我们可以通过一次建库，测得上万个单细胞的信息
传统测序方法所展示的信息也是在多细胞水平上的平均信息，而单细胞水平上的测序则完全可以反应同一个细胞群里不同细胞的基因组和转录组状况。单细胞测序技术的出现，使得从混杂的样品中筛选出异质性信息的难题得以解决
droupout : 单细胞中的 droupout 指的是由于测序技术本身的天然缺陷， 导致本应该表达的基因， 在测序技术中没有被测到， 且该比例极高
一部分是实际的细胞本身就不表达该基因，我们称之为True
一部分是细胞实际上表达了，但是被没测到，或者说表达量极少由于测序和比对误差导致的没有，这种情况称为 False
RNA基础
DNA 指导合成 RNA ，mRNA传递遗传信息 rRNA（ribosome）合成核糖体， tRNA转运 氨基酸
实验组 对照组
