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Tipos de Cromatografía utilizados en la purificación proteica
*Cromatografía de exclusión molecular
Es el proceso de separación de biomoléculas de acuerdo a su tamaño cuando una solución fluye a través.
Se utilizan las propiedades de tamiz molecular de una variedad de materiales porosos
El proceso de separación depende del tamaño y el volumen hidrodinámico, el cual define la capacidad de la molécula de penetrar o no en los poros de la fase estacionaria.
Cromatografía de intercambio iónico
Separa las moléculas con base a su carga iónica neta
La separación se lleva a cabo por la competencia entre proteínas con diferente carga superficial por grupos cargados opuestamente sobre un adsorbente o una matriz de intercambio iónico.
Es una de las técnicas de purificación de proteínas más usadas.
Las interacciones hidrofóbicas reversibles entre los solutos son controladas con el objetivo de favorecer la unión o elución de moléculas especificas logrando su separación
Una proteína que no tiene carga a un pH equivalente a su punto isoeléctrico no podrá interactuar con la matriz o fase estacionaria cargada
Un pH por encima de su punto isoeléctrico una proteína podrá ligarse a una matriz cargada positivamente o intercambiador aniónico, a un pH por debajo de su pH, una proteína podrá unirse a una matriz cargada negativamente negativamente o intercambiador catiónico.
Existen en estado de equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria, dando lugar a dos tipos; aniónico y catiónico
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Es uno de los métodos de purificación de macromoléculas biológicas más utilizados, especialmente para proteínas.
Los mecanismos de absorción en el cual están basados las interacciones hidrofóbicas de las moléculas con la fase estacionaria fueron demostradas por Tiselius en 1940
La interacción reversible entre la superficie hidrofóbica de una proteína y una matriz cromatográfica con un ligando hidrofóbico a altas concentraciones, como el sulfato de amonio.
Este tipo de sales tiene alta polaridad y se unen fuertemente al agua, lo cuál induce la exclusión del agua sobre la proteína y la superficie del ligando lo que promueve las interacciones hidrofóbicas y la precipitación de la proteína
Un incremento en la longitud de la cadena de un ligando alquilo aumenta la fuerza de la interacción hidrofóbica entre la proteína y la resina
Un incremento en el grado de sustitución de la resina lleva a un aumento en la capacidad de unión de la fase estacionaria, debido a la alta probabilidad que se formen múltiples puntos de unión y en ocasiones esto puede hacer difícil la elución de la proteína ligada sin desnaturalizarla.
Una proteína débil puede requerir de un ligando hidrofóbico fuerte para asegurar la unión.
Las matrices preparativas más usadas son frecuentemente de polímero naturales como agarosa o dextrano, pueden estar compuestas por poliacrilamida
Son usada analíticamente para estudiar la pureza de las proteínas, su plegamiento, las interacciones proteínas - proteínas, etc.
La cromatografía de exclusión molecular es frecuentemente utilizada como un paso final del producto.
La elección del ligando es esencialmente empírica, se puede hacer uso del conocimiento básico que se tenga sobre la proteína de interés.
Una proteína hidrofóbica débil puede requerir de un ligando hidrofóbico fuerte para asegurar la unión.
Cromatografía de fase reversa
Describe un tipo de cromatografía en la cuál la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil
Es una técnica de purificación capaz de separar componentes con características muy similares, como proteínas que difieren en sólo un aminoácido e isómeros conformacionales de péptidos
La asociación de una molécula con la fase estacionaria puede ocurrir tanto por partición como por absorción.
Las matrices de alta porosidad proporcionan una superficie interna de alta capacidad de unión
La silica es producida a pH bajos y solventes orgánicos. Los ligando que están unidos a soportes de silica son; octil (C8), octadecil (C18), fenil o metil (C2)
Los polímeros orgánicos sintéticos, como el poliestireno, son utilizados como matrices cromatográficos en RPC.