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ELABORACION DE UNA TINCION DE GRAM - Coggle Diagram
ELABORACION DE UNA TINCION DE GRAM
La tinción de Gram casi siempre debe realizarse como el primer paso en el diagnóstico de una infección bacteriana.
La tinción de Gram es un procedimiento rápido que se usa para buscar la presencia de bacterias en muestras de tejidos y caracterizarlas como Gram positivas o Gram negativas en base a las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares.
PARTE 1. preparar el porta objetos 1. Colócate guantes y amárrate el cabello si lo tienes largo para evitar contaminar la muestra de bacteria que vayas a analizar. Desinfecta un espacio de trabajo debajo de la campana extractora o en otra área bien ventilada. Antes de comenzar, revisa que el mechero Bunsen y el microscopio estén operativos.
Esteriliza un portaobjetos de vidrio para microscopio. Si el portaobjetos está sucio, lávalo con agua jabonosa para eliminar la grasa y la suciedad. Desinféctalo con etanol, limpiador de vidrios o el método que recomiende tu laboratorio.
Coloca la muestra en el portaobjetos. Puedes usar el método de la tinción de Gram para ayudar a identificar las bacterias presentes en muestras médicas o en cultivos de bacterias en una placa de Petri. Para que la tinción de Gram sea útil, coloca una capa delgada de la muestra sobre el portaobjetos.
Si vas a tomar bacterias de una placa de Petri, esteriliza un asa bacteriológica en la llama de un mechero Bunsen hasta que brille, luego deja que se enfríe. Úsala para colocar una gota de agua esterilizada sobre el portaobjetos y luego esteriliza y enfría el asa otra vez antes de transferir una pequeña muestra de bacteria al portaobjetos y revolverla suavemente en el agua.
Si vas a usar una muestra de tejido, coloca de 1 a 2 gotas de la muestra en el portaobjetos de vidrio. Extiéndela uniformemente sobre el portaobjetos para formar una mancha delgada usando el borde de un segundo portaobjetos de vidrio esterilizado. Deja que se seque con el aire antes de continuar.
Las bacterias en un medio de cultivo deben mezclarse en un agitador de vórtice y luego colocarse en el portaobjetos con un asa bacteriológica, como se indica anteriormente, pero sin agregar el agua adicional.
Si tienes una muestra en un hisopo, pásalo ligeramente por encima del portaobjetos
4.Fija la muestra por calor. El calor fijará las bacterias al portaobjetos de forma que no se enjuaguen tan fácilmente durante la tinción. Pasa rápidamente el portaobjetos dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen o caliéntalo sobre un calentador de portaobjetos eléctrico. No lo sobrecalientes o las muestras podrían distorsionarse. Si vas a usar un mechero Bunsen, la llama debe ser un cono pequeño y azul, no uno alto y anaranjado
*Alternativamente, la muestra puede fijarse con metanol, agregando 1 o 2 gotas sobre la mancha seca, drenando el exceso de metanol y dejando que se seque con el aire. Este método minimiza el daño a las células huésped, dándoles un fondo más limpio.
Posiciona el portaobjetos en una bandeja para tinción. Una bandeja para tinción es una bandeja poco profunda de metal, vidrio o plástico con una pequeña malla o soporte de alambre a lo largo de la parte superior. Coloca el portaobjetos sobre este soporte de forma que los líquidos que vayas a usar puedan drenarse sobre la bandeja.
Si no tienes una bandeja para tinción, el portaobjetos puede colocarse directamente sobre una cubeta de plástico para hielo.
PARTE 2. REALIZAR LA TINCION DE GRAM . 1. Empapa la muestra con cristal violeta. Usa una pipeta para empapar la muestra de la bacteria con varias gotas de tinte cristal violeta, a veces llamado violeta de genciana. Espera de 30 a 60 segundos. En una solución acuosa, el cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro (Cl-). Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de células tanto Gram positivas como Gram negativas. El ion CV+ interactúa con los componentes con carga negativa de las células bacterianas para mancharlas de violeta.
Muchos laboratorios usan el cristal violeta de "Hucker", el cual agrega oxalato de amonio para evitar la precipitación
Enjuaga suavemente el cristal violeta. Inclina el portaobjetos y usa un matraz de lavado para rociar un pequeño chorro de agua destilada o de grifo sobre la parte superior del portaobjetos. El agua debería escurrirse sobre la superficie de la mancha pero no estar apuntada directamente a ella. No enjuagues excesivamente, lo cual puede quitar la tinción de las bacterias Gram positivas.
Empapa la mancha con yodo y luego enjuaga. Usa una pipeta para cubrir la mancha con yodo. Déjala reposar por lo menos por 60 segundos, luego enjuágala cuidadosamente con el mismo método. El yodo, en la forma de iones con carga negativa, interactúa con los iones CV+ para formar grandes compuestos de cristal violeta y yodo (compuestos CV-I) dentro de las capas interiores y exteriores de la célula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la célula, en el lugar en el que la haya teñido.
Agrega un decolorante y luego enjuaga rápidamente. Para este paso crítico, se usa normalmente una mezcla de acetona y etanol en una proporción de 1:1. La realización de este paso debe calcularse cuidadosamente. Sujeta el portaobjetos en ángulo, luego agrega el decolorante hasta que nada del color violeta sea visible en la escorrentía. Esto normalmente toma menos de 10 segundos o incluso menos tiempo si el decolorante contiene una alta concentración de acetona. Detente inmediatamente o el decolorante retirará la tinción de cristal violeta de células tanto Gram positivas como Gram negativas y la tinción tendrá que repetirse. Enjuaga inmediatamente el exceso de decolorante usando la técnica mencionada anteriormente.
Puede usarse acetona pura (95%+) en su lugar.Mientras más acetona haya, el decolorante trabajará más rápido, lo que requerirá un cálculo más preciso del tiempo.
Empapa la mancha con un colorante secundario y luego enjuaga. Se usa un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un contraste adicional entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiñendo las bacterias decoloradas (Gram negativas) de rosado o rojo. Deja el colorante en la muestra por lo menos por 45 segundos, luego enjuágalo.
La fucsina teñirá muchas bacterias Gram negativas de forma más intensa, como las especies Haemophilus y Legionella. Esto puede convertirla en una mejor opción para principiantes.
EXAMINAR EL RESULTADO.
PARTE 3.
Prepara el microscopio óptico. Coloca el portaobjetos bajo el microscopio óptico. Las bacterias varían en gran medida en tamaño, así que la magnificación total requerida variará de 400x a 1000x En el extremo más alto de estas magnificaciones, se recomienda usar una lente objetiva con aceite de inmersión para una mayor claridad. Coloca una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos, evitando el movimiento durante la aplicación para evitar las burbujas. Mueve el revólver del microscopio de forma que la lente objetiva se posicione en su lugar con un clic, tocando el aceite.
El aceite de inmersión solo puede usarse en lentes diseñadas especialmente, no en una lente "seca".
2.
Identifica las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Examina el portaobjetos bajo el microscopio óptico. Las bacterias Gram positivas se verán violetas debido al cristal violeta atrapado en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas se verán rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuagó a través de las delgadas paredes celulares y luego ingresó a ellas el colorante secundario rosado.
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Si la muestra es demasiado gruesa, puedes obtener falsos positivos. Tiñe una nueva muestra si todos tus resultados son Gram positivos, para asegurarte de que el resultado sea correcto.
Si el decolorante se escurrió por mucho tiempo, puedes obtener falsos negativos. Tiñe una nueva muestra si todos tus resultados son Gram negativos para revisar los resultados dos veces.
Busca imágenes referenciales. Si no estás seguro de lo que es una bacteria, busca en colecciones de imágenes referenciales clasificadas por forma y resultado de la tinción de Gram.
4.
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SECA EL PORTA OBJETOS Puedes dejar que el portaobjetos se seque con el aire o secarlo usando papel absorbente que se venda para este propósito.La tinción de Gram está terminada.
