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Techniques utilisant les Anticorps marqués - Coggle Diagram
Techniques utilisant
les Anticorps marqués
Techniques d’Immunofluorescence
Fluorophore :
-Isothiocyanate de Fluorescéine
(FITC) → B-V
-Isothiocyanate de Rhodamine
-Phycoérythrine
propriétés
en présence d’un excès modéré de fluorochrome (FITC).
Temps de contact prolongé : 18 heures au moins ;
à + 4°C ou à température ambiante ;
à pH =9,4 (Alcalin) en tampon bicarbonate.
le groupement amine de la lysine (de la protéine à marquer) -le groupement thiocyanate de la FITC→ liaison covalente
la fluorescence se mesure grâce à un microscope de fluorescence
3 types
Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD) ;
Ac spécifique (marqués )de l’Ag
(Conjugué) +coupe du tissu →utilisée en anapath
Réactions d’Immunofluorescence Indirecte (IFI) ;
Ag + sérum+ Anti Ac marqué (Le marquage d’un seul type d’immun-sérum permet la détection de tous les Ac à rechercher )→ Méthode de choix dans le diagnostic des Maladies Auto-Immunes .
Réactions de Double Marquage.
Utilisation de plusieurs marqueurs fluorescents dans la même réaction→ trés utilisée en cancérologie
Lecture →Microscopie Confocale (doté de 3 filtres, pour chaque couleur )
Techniques Immuno-Enzymatiques
Techniques Enzymo-
Immunocytochimiques : qualitatif/semi quantitatif
utilisent des Ac marqués aux Enz pour localiser des constituants présents dans des Tissus ou des Cell :Procédés identiques à ceux de l’Immunofluorescence.
Dosages
Immuno-enzymatiques : quantitatif
phase hétérogène :Une phase solide est nécessaire pour immobiliser l’Ag/l’Ac associé à l’enz afin d'évaluer l’activité enz du complexe immun
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
Dosage de type compétitif
Ag limitants fixé sur une plaque + Ac à doser + Ac marqués par une enz →la quantité d'Ac/Ag est inversement proportionnel au signal obtenu
Dosage de type non compétitif
direct
dosage de l'Ag
indirect
Dosage de l'Ac
de type sandwich
l'Ag doit posséder 2 épitopes différents
il est pris en « Sandwich » entre 1 Ac fixé & 1 Ac marqué.
La DO (Densité Optique) est directement proportionnelle
à la quantité d'Ac/Ag mesurés.
La révélation consiste à mesurer l’activité catalytique de l’enzyme par Spectrophotométrie (Densité Optique).
qualitative
valeur seuil (cut-off)
En Ratio : un Ratio > 1 est, en général, considéré comme positif
En Titre : sérum à tester par rapport à la valeur seuil ;
quantitative
courbe d'étalonnage
En Unités Arbitraires (UA/ml) ;
En Unités Internationales (UI/ml).
phase homogéne : le dosage du complexe immun s’effectue directement dans le mélange réactionnel liquide
enzymes :peroxydase (S:Eau Oxygénée ) / phosphatase alcaline(P. Nitrophenyl Phosphate, Naphthol As Phosphate)
types de conjugués
Conjugué simple : « Ag– Enz »
Conjugué associant le couple biotine -Avidine
Conjugué simple : « Ac– Enz »
technique immuno-radiologiues (le meme principe qu'ELISA)
Par compétition:RID : Radio-Immuno-Dosage
sans compétition:DRIM : Dosage Radio-Immuno-Métrique
Iode125 , C14
FLUORO-IMMUNO-DOSAGE
Marqueur luminescent :émet un signal provoqué par un apport d’énergie ext
ex : isothiocyanate de fluoréscéine , europium
émission
indirect :
D’une molécule transformée par une enzspécifique utilisée comme marqueur.
direct : par le fluophore
sans compétition
IFMA : immuno-fluoro-metric assay
par compétition
FIA : Fluoro-Immuno-Assay
Chimiluminescence :Réaction chimique provoquée par l’addition d’un réactif chimique approprié →se caractérise seulement par un spectre d’émission.
marqueurs : ESTERS D’ACRIDINIUM
,DIOXETANES ,PHTAHLYDRAZIDES (luminol,Isoluminol)