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Hypoxie et mécanismes moléculaires de différenciation & Applications…
Hypoxie et mécanismes moléculaires de différenciation
&
Applications à l'ingénierie tissulaire du cartilage
Intro Hypoxie
= réduction niv O2 entre 2 conditions (très relatif)
Peut être limitée à certaines cellule dans un même tissu ou organe
Chronique = longtemps ou aigue = pic ou chute
Continue ou intermittente
Pdt dif° : csE évolue dans env hypoxique car par de vasc° dans l'env maternel : ~2% → 8% après connexion à la circu mat
Physioxie : taux normal (cS adulte ~2%)
Cell en hypoxie : adaptation en modifiant comportement, notamment la prod d'ATP → modif mito : prod ROS → HIF → gènes cibles augmentent ou diminuent
Voies régulées par hypoxie : HIF, AP1, jun, NFkB, TGF, CREB, voie transport d'O2 (prot), voie angio, voie glycoyse, pH, FC, ck, prot matricielles, MDR1 ...
HIF1
Superfamille HLH
Hétérodimère : HIF1 alpha/beta → cofacteur (chrms diff), alpha ne peut pas cibler gènes seul mais le seul à avoir domaine
ODD
sensible à l'oxygène
Séq spé sur gène cible
HRE = Hypoxie Responsive Element
: G ou A/CGTG
HIF1 beta peu régulé : exp° constitutive
ARNm → alpha → nbreuses voies en amont : PI3K, MAPK, NFkB ...
Régulation post trad
en normoxie,
prolyle hydrolase = PHD
hydroxyle les groupements phosphate → ub° par E3 ligase et dégradation. Peut être mimé par
cadmium
en hypoxie : PHD inhibée → translocation HIF1 alpha dans noyau pour asso a beta. Peut être mimé par cobalt
Inhibiteur HIF :
FIH
présent en normoxie
Ex d'interaction avec FT
p53 : dégrad° HIF1 via recrutement E3 ligase et promeut stabilité de p53
TCF4 (T cell factor)
: en compétition pour liaison avec Beta-caténine
Smad3 : coopère avec HIF1 pour activer prom de VEGF → synergie hypoxie TGFbeta
c-myc : complexe avec HIF régule cycle cellulaire
HIF1 et 2
Semblables (séq) mais fonctionnement diff
HIF1 alpha exprimé dans tous les tissus chez Vertébrés et Invert. tandis que HIF2 alpha pour certains types cellulaires (hématopoiétique, niches et poumons)
• Cibles communes : GLUT1, VEGF ...
• Cible HIF1 : BNIP3, CAR9, LDHA, PGK1 ...
• Cibles HIF 2 : nanog, Oct4, SOX 2 dans cSE humaines → pluri
→ form° métastases, angio, métabolisme énergétique tumoral, dif°
Rôle reprog iPS :
In vitro : HIF1 se fixe sur HRE mais HIF2 alpha non
Natif : HIF2 oui mais HIF1 alpha non
Rôle HIF1 : glycolyse & HIF2 : synthèse AG
Hypoxie et cartilage
Formation cartilage : ossification endochondrale dans env hypoxique
Avasculaire : nutriment et O2 proviennent de diffusion de l'os ou de la lumière articulaire
Act° HIF continue indispensable à survie, prolif et dif° chondrocytraire
Ingénierie tissulaire
cell + biomatériaux + signaux → nouveau tissu fonctionnel
Alginate
Polysaccharides extraits d’algues brunes
Insoluble dans l’eau
Polymérisation avec des cations
Recul suffisant in vitro
Tolérance in vivo
Biodégradable
Injectable in vivo
Un des objectif : hypoxie seule comme inducteur de chondrogenèse pour restaurer phénotype chez chondrocytes dédifférenciés / pour induire dif° chondrogénique de CSM
Exp° génique au cours de la dédif°
Chondrocytes matures : COL2A1 (diminue au fil des passages) et agrécane (pareil)
Chondrocytes dédif : passage augmente COL1A1 et COL3A1
Influence hypoxie sur phénotype chondrocytaire de P2 (dédifférencié)
Normoxie 3D : retrouve phénotype avec exp° coll II et agrécane et diminution coll I et III (marqueurs de dédif°)
Hypoxie 3D : augmentation exp° coll II et agrécane + important → hypoxie favorise redif° chondrocytaire
Effet chlorure de cobalt et chlorure de cadmium validé et montre modulation SOX9 (spé des chondrocytes) et agrécane → HIF1 se fixe sur prom de agrécane et SOX9
CSM
Intro
cS post natale d'origine mésodermique chez l'adulte → m-o mais aussi os, cartilage, tissu adipeux, muscle, cordon...
Capacité d'immunosup donc pas de rejet si injection
Marqueurs : CD44, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166, CD131, CD28, CD33 et HLA I → doivent être négatifs pour CD11b, CD14, CD31, CD34, CD45, CD117 (marqueurs hématopoietique)
Purif en mise en culture avec passage et milieu sélectif : disparition cell hematopoietique
Capacité de dif° en ostéoblaste, chondrocyte et adipocyte
Exp : culture 3D en hypoxie avec alginate
Pic agrécane et coll II dû à HIF1 puis augmentation :
Validation in vivo : cell m-o ou cartilage → alginate dans bille → 3D en hypoxie → implantation dans souris nude
→
form° cartilage (+ efficace qu'en normoxie) → thérapie cellulaire envisageable avec CSM
Modèle de reconstitution de cartilage
Avantages : pas de FC exogènes pour induire dif°, baisse d'intervention cellulaire, pas de vecteurs, coût moindre, alginate injectable donc peu invasif
Reste à faire : gros animal, tailles lésions à traiter ? → quelles cibles ? quel cartilage (articulaire...) ?, coût ttt, à qui ça va s'adresser ?
