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MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA - Coggle Diagram
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Fluorescencia
FENOMENOS DE BIOLUMINISCENCIA
Mecanismo de emisión de luz por parte de organismos
Capacidad o propiedad de ciertas sustancias o moléculas de emitir luz
Quimiobioluminiscencia
Reacción química: enzima + sustrato
Energía residual
Luz
Luciferasa + luciferina
Luciernagas
Fosforescencia
Emiten luz por si mismos
Fluorescencia
Radiación electromagnética de onda corta y alta energía
longitud de onda más larga y de baja energía
Diagrama de Jablonski
Deben ser irradiados
Proteínas Fluorescentes
Osamu Shimomura -1968
Medusa Aequorea victoria
Aequorin
Green Fluorescent Protein.
En la actualidad cubren prácticamente todo el espectro de luz visible
Fusión con proteínas de interés
Permite observar la localización de la proteína quimérica manteniendo las células intactas
Combinando proteínas de interés + orgánulos específicos logran estudios de localización, tráfico y movimiento de proteínas
Marcaje de células o tejidos
Visualización de la morfología, localización y movimiento de las células o tejidos
Desarrollo embrionario o procesos tumorales
Mecanismo de fluorescencia
Implica tres pasos secuenciales
Absorción
Disipación
Emisión
transcurre en un tiempo muy corto
esto diferencia la
fluorescencia
de la
fosforescencia
sustancias capaces de emitir luz al ser excitadas radiación se denominan:
Fluoforos o Fluorocromos
Aplicaciones del microscopio de fluorescencia
Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación
Estudio de células normales y patológicas.
Estudios inmunológicos.
Mineralogía.
Fluorocromos
Tipos
Cascade blue
Fluoresceína (FITC)
Rodamina (TRITC)
Naranja de acridina
Yoduro de propidio
Fluorocromos intracelulares naturales
nucleótidos reducidos
NADH, NADPH
nucleótidos de flavina oxidados
clorofilas
proteínas fluorescentes
cada uno de ellos tiene su aspecto de absorción y emisión
depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente
Partes de un microscopio de fluorescencia
Fuente de luz
Excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo
Filtros
Permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda
Objetivos
Capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad
Microscopio Confocal
Imágenes digitales de alta resolución
Produce secciones ópticas a lo largo del eje z de una muestra marcada con uno o varios fluorocromos
Fuente de iluminación distintos tipos de láser controlados por un sistema óptico de filtrado
Lámpara de mercurio
Visualización de estructuras de hasta 200 nm de tamaño real
Limitaciones
Requiere un tiempo considerable escanear cada plano focal
Puede provocar fotoblaqueo del fuorocormo
Limita el número de imágenes que se pueden obtener.
Limitaciones
Primero
la luz fluorescente emitida por la muestra no solo proviene del plano de foco sino tambien de las moleculas por encima y por debajo de el
superposición de imágenes
efecto difuminado
Segundo
para observar muestras gruesas, se deben obtener imágenes consecutivas a diversas profundidades y luego alinearlas.