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iPSC, une alternative aux cellules souches embryonnaires et adultes ? -…
iPSC, une alternative aux cellules souches embryonnaires et adultes ?
Reprogrammation
Approches de reprogrammation nucléaire
Fusion cellulaire
Transduction de FT
Transfert nucléaire
Reprogrammation direct → cellules pluripotente
Oct 3/4 + SOX2 +
Klf4
/c-myc ] FT
Nanog + Oct4 + SOX2 +
LIN28
Méthodes
Transfection intégrative virale (+ efficace) : via rétrovirus et lentivirus → intègre systèmes d’excision permettant
d’enlever les facteurs de reprog° qui se seraient intégrés dans la
séquence d’ADN de la cellule reprogrammée
Transfection non intégrative virale : adénovirus, virus adéno-associée (AAV), respirovirus murin
→ Efficacité et sécurité inversement corrélée
Vecteur auto-excisant : transposon
Transfection non intégrative non virale : plasmide (faible efficacité), ARN, prot recombinante (obtention de lignée iPS murines et humaines avec prot codées par gènes de la reprog° taguées avec un peptide poly-Arg permettant passage transmbR), miARN (acteurs majeurs de la rég° des propriétés de pluripotence), petites mol chimiques (modulateurs épigénétiques et mol de signa intracell favorisent reprogrammation).
Cellules souches
Différents types définis par leurs potentialités de dif°
Multipotente : capacité à donner au moins 4 progénies diff
• Tissulaire : CSM → ostéocytes, adipocytes, chondrocytes, cell du muscle lisse
• CSH → lignage hématopoïétique
Concept de Waddington
: "Les cS perdent leurs caractéristiques souches lorsqu'elles évoluent au cours du dév vers un type cellulaore
(+) facile pour une cell de se dédifférenciée avant de se redifférencier en un autre type
iPS et cSE
Profil semblable : prolif, morpho, pluripotence, marqueurs, profil d'exp°, épigénét, dif° in vitro et form° de tératomes MAIS pas identiques
iPS : act° gènes de pluri, act° télomérase, réactivation chrms X silencieux, form° tératomes et chimères, silencing transgènes rétroviraux
Induction expérimentale de la pluripotence : Ctrl qualité
Identif° clones reprogrammés
IF : Ac anti prot embryonR
Phosphatase alcaline : marqueur de cS pluri
Morpho : bordure réfringentes (réfraction) et colonies compactes
Variation épigénétique
Caryotype : présente altération au début donc question de quand regarder
Mutation
Augmentation des variation de nt au cours de la reprogrammation qui diminue au cours des passages
Mutations somatiques déjà présentes donc amplifiées ou qui apparaissent lors de la reprogr°
→ Séquençage des lignées indispensable
Statut de méthyl° des iPS : reconfiguration complète
→ obs° dynamisme de la chromatine : histone, ouverture, implication miARN...
Analyse de la pluripotence
Immunohistochimie : loca marqueurs cellulaire
Cyto en flux : exp° marqueurs membranaires
RT-PCR ou WB
Puce d'exp°
Evaluer capacité de dif°
Cellules pluripotentes
Caractéristiques
Prolif illimitée in vitro
Exp° Oct4, Nanog, SSEA4
Différenciation in vitro : Cellules des 3 feuillets (ectoderme, endoderme, mésoderme)
Capacité de former des tératomes sur souris immunodep
Marqueurs : Oct4, nanog, TRA 1-60, TRA 1-81, SSEA3/4, MDM2 (prot ligase), SOX2,
REX1
(FT),
hTERT
(telomerase), DNMT3b (methyltransferase)
Potentiels thérapeutiques : modélisation patho, médecine personnalisée en criblant cell du patient et trouver médoc adéquats MAIS tératome possible
Médecine régénératrice
= remplacer un tissu lésé par un sain et restaurer les act fonctionnelles
Ingénierie tissulaire
Thérapie cellulaire
Thérapie acellulaire : issu de cell mais qu'on utilise pas →
cell based-cell free*. Avec exosomes = nano vésicules contenant nbreuses mol → thérapie basée sur
sécrétome**
cS + nombreuses que cell tissulaire et greffe autologue ou allogénique sans rejet
Autres applications : screening de mol et modélisation patho. Essai clinique au Japon → Parkinson, DMLA, lésions cardiaques
Cas de l'arthrose
Dégradation matrice par MMP et impossibilité de synth de coll II donc synth de coll I donnant fibrocartilage ← dédif° chondrocytaire
1ere génération : transplantation chondrocytes autologues sous mb de périoste
Biomatériaux, mol bioactives ou cell seules → substituts bio
Mimer µenv du cartilage afin de différencier CSM en chondrocytes avec cordon mais si passage (amplif) augmente sénescence aussi
Articles arthrose
iPS générées de fb de souris adulte pour substitut cartilagineux
Exp° marqueurs pluri, obs° tératome...
Synth de coll II et agrécane MAIS forte diminution après 1er passage
Augmentation de synth coll X : caract du phénotype hypertrophique
→ pas stable
Ajout TGFbeta et dexaméthanone (corticoïde qui active SOX9)
Diminution exp° GAG
Synth coll II importante, Coll I en faible quantité si pas trop de passage, Coll X synth aussi
Implantation sur explant de cartilage de porc
→ superposition entre cartilage et tissu généré in vitro
Stimulation mécanique
Favorise profil chondrocytaire et obs° marqueurs pluri
Form° tératome si temps de culture pas assez long
Intérêt exosome : sécrétome
Procédés d'industrialisation bcp + envisageable que les "cellules médicaments"
Impact sur la prolif des chondrocytes
Analyses
RT-PCR ou WB : ARNm ou prot de l'ensemble des cell de la culture (on ne sait pas si homogène)
IF : quantif cell exprimant marqueurs cS
FACS : on peut voir la prop des cell exprimant les fcteurs