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Pesquisa de Salmonella spp., S. Typhimurium e S. enteritidis em alimentos…

- - - - 0,1 mL do cultivo + 10 mL de meio Rappaport Vassiliadis (RV)
        (41,5ºC por 24h)
        
        Alta pressão osmótica
        
        pH baixo
        
        Componente bacteriostático: Verde de Malaquita
        
        Temperatura de inibição também inibe algumas bactérias
        
        Plaqueamento seletivo e diferencial
        
        Promover o crescimento apenas das colônias típicas de Salmonella spp.
        
        Inocula-se por estriamento a partir dos cultivos anteriores e incuba-se por 24h a 36ºC
        
        ISO pede a utilização do ágar XLD e também usa-se o ágar BPLS ou outros
        
        Ágar BPLS: verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose
        
        Seletivo e diferencial
        
        Tem lactose e sacarose, glicídios que Salmonella spp. não fermenta, então se o indicador (Vermelho de Fenol) mudar a coloração, há indícios de que a bactéria presente não é Salmonella
        
        Possui alguns inibidores: novobiocina, verde brilhante e sais biliares
        
        :red_flag: Colônias de Salmonella spp. são rosadas rodeadas por uma zona avermelhada, já colônias de outras bactérias (E. coli, Citrobacter, Proteus vulgaris, Klebsiella...) ficam com aparência amarelo-esverdeda, rodeadas por uma zona amarelada.
        
        Ágar XLD: xilose lisina desoxicolato
        
        Inibidor é o desoxicolato de sódio
        
        Também possui sacarose e lactose, além de xilose como carboidratos, sendo também o Vermelho de Fenol o indicador de pH.
        
        Permite a visualização de formação de H2S, que deixa as colônias pretas/marrons escuras
        
        Contem lisina, que pode ser descarboxilada, formando uma base que alcalinizará o meio.
        
        :red_flag: Colônias de Salmonella spp. são rosadas rodeadas por uma zona avermelhada, e aguns sorovares produzem H2S, deixando as colônias pretas/escuras
        
        Outros ágares utilizados:
        - Hektoen Enteric Ágar: também detecta a formação de H2S, também possui carboidratos fermentáveis (lactose, sacarose e salicina) mas o indicador de pH é o Azul de Bromotimol;
        - Ágar SS (Salmonella Shigella): bastante comum, tem inibidores de gram positivas (sais biliares, verde-brilhante e citrato sódico) e o usa o Vermelho neutro como indicador de fermentação da lactose, além de também detectar formação de H2S.
        :warning: Diferente dos casos anteriores, no Ágar SS os microrganismos que FERMENTAM lactose possuem colônias ROSADAS, já os não fermentadores (como a Salmonella) possuem colônias transparentes (que aparentam ser amareladas por causa da cor natural do meio).
        
        Colônias típicas são selecionadas para isolamento
        
        São selecionadas 5 colônias típicas para realização da próxima etapa
        
        Semeia-se as colônias em Ágar BHI e incuba-se novamente a aproximadamente 35 ºC por 24h
        
        Testes Bioquímicos e Sorológicos
        
        Triagem bioquímica:
        
        TSI (Triple Sugar Iron):
        
        Contém glicose, sacarose e lactose. Salmonella NÃO FERMENTA LACTOSE E SACAROSE
        
        Possui sulfato de amônio ferroso e tiossulfato de sódio para identificar a produção de H2S
        
        Inocula-se no tubo inclinado primeiramente em picada com agulha estéril de platina (identificar anaerobiose) e em estrias na rampa (identificar aerobiose) e incuba-se (37 ºC por 24h)
        
        :warning: Tem que incubar com a tampa frouxa para não correr o risco do tubo estourar caso haja formação de gás
        :red_flag: Na região anaeróbia (inferior), como a Salmonella é capaz de fermentar glicose, haverá acidificação do meio, consequentemente virando o indicador (Vermelho de Fenol) para a cor AMARELA. Na região aeróbia (superior), após fermentar toda a glicose do meio, como não é capaz de fermentar os outros carboidratos, a Salmonella irá degradar o substrato proteico presente, alcalinizando o meio, que ficará ROSA. Alguns sorovares são capazes de produzir H2S, através do tiossulfato de sódio presente no meio, o qual irá reagir com o sal de amônio ferroso precipitando sulfureto de ferro, deixando uma região do tubo PRETA/ESCURA
        
        LIA (Ágar Lisina):
        
        Inocula e incuba da mesma forma descrita para o TSI
        
        Permite visualizar se há ou não descarboxilação da lisina, além de também indicar a formação de H2S
        
        O indicador de pH é o Púrpura de Bromocresol
        
        :red_flag: A Salmonella é capaz de descarboxilar a lisina, o que faz com que o meio permaneça na coloração original. Isso acontece porque mesmo fermentando a glicose do meio, há a descarboxilação da lisina, produzindo CADAVERINA, que é um composto alcalino, o que acaba neutralizando o ácido. Pode haver precipitação de sulfureto de ferro se houver produção de H2S
        
        Ureia:
        
        O meio contém ureia como substrato e pretende avaliar se um microrganismo te a enzima urease, que hidroliza esse composto
        
        Possui Vermelho de Fenol como indicador
        
        A inoculação deve ser feita através de estrias somente na rampa do tubo inclinado, e incuba-se da mesma forma descrita para o TSI
        
        :red_flag: Salmonella NÃO PRODUZ UREASE portanto o meio deve permanecer na cor original, que é AMARELO.
        
        Série Bioquímica:
        Para Salmonella spp, é opcional a realização
        
        Indol: Caldo Triptona, incuba-se igual ao TSI. Avalia a capacidade do microrganismo de produzir triptofanase. Utiliza-se o Reagente de Kovak para revelar. Reação positiva produz coloração vermelha na camada superior do tubo. Para Salmonella o teste é negativo.
        
        VM (Vermelho de Metila):Determina se o microrganismo é capaz de produzir ácidos fermentando glicose, usando o Vermelho de Metila como indicador. Incuba-se a 36 ºC por 72h. Para Salmonella o teste é positivo (quase sempre).
        
        VP (Voges Proskauer): Avalia se a bactéria converte glicose pela via butilenoglicólica, produzindo acetoína. Incuba-se a 36 ºC por 48h. Ao adicionar KOH na presença de oxigênio, a acetoína se converte em diacetila, e com a adicão de alfa-naftol, a coloração do tubo se torna vermelho-cereja. Para Salmonella o teste é negativo
        
        Citrato: Ágar Citrato de Simmons, onde a única fonte de carbono disponível é o citrato. Incuba-se como o VP. Se faz estrias na rampa. Se o microrganismo usar o citrato, o meio vai ser alcalinizado e o meio mudará de verde para azul. Para Salmonella o teste é positivo
        
        Motilidade: Pode usar o meio SIM também. Inoculação por picada, incuba-se como o TSI. Difusão de crescimento pelo meio através da picada indica motilidade. Para Salmonella o teste é positivo (maioria)
        
        Malonato: Meio contém o malonato como única fonte de carbono, se a bactéria usar o composto, o meio muda de azul para verde. Incuba-se como o VP. Para Salmonella o teste é negativo
        
        Dulcitol: Cultura inocualada em caldo Vermelho de Fenol com dulcitol, incuba-se como VP. Caso haja fermentação do dulcitol, o meio muda de cor do vermelho para o amarelo. Também pode se verificar ou não a produção de gás. Para Salmonella o teste é positivo, com ou sem produção de gás no aerômetro
        
        Identificação Sorológica
        Serve para confirmar que o gênero é Salmonella spp., e também pode ser usado para identificar o sorotipo de Salmonella.
        
        Prova de Soroaglutinação:
        Reação antígeno-anticorpo, com consequente aglutinação do antígeno frente à exposição ao anti-soro para Salmonella polivalente "O", "Vi" e "H"
        
        Antígeno O: antígeno somático
        
        Antígeno H: antígeno flagelar
        
        Antígeno Vi: antígeno capsular (menos usado em alimentos)
        
        2 more items...
      - 1mL do cultivo + 10mL de caldo Tetrationato (TT)
        (37ºC por 24h)
        
        Podem ser adicionados outros inibidores, como o verde brilhante para inibir espécies de Proteus, iodo e antibióticos
- - - - Resultado das provas bioquímicas:
        
        TSI: Porção superior rosada com enegrecimento do fundo, indicando produção de H2S
        
        LIA: Manutenção da cor do meio com precipitação escura indicando produção de H2S
        
        Ureia: Ausência de produção de ureia
        
        Indol: Negativo
        
        VM: Positivo
        
        VP: Negativo
        
        Citrato: Positivo
        
        Malonato: Negativo
        
        Motilidadade: Positivo
        
        Dulcitol: Positivo
        
        De acordo com os resultados das provas bioquímicas, foi identificado que o microrganismo presente provavelmente pertence ao gênero Salmonella spp. Para confirmação e identificação do sorovar, foram realizadas as análises sorológicas a partir da cultura em BHI, obtendo-se os seguintes resultados:
        
        Aglutinação como soro polivalente presente
        
        Aglutinação com O:4 presente
        
        Aglutinação com O:5 presente
        
        Aglutinação com H:i e H:2 presente
        
        Tendo em vista todos os resultados, concluiu-se que a amostra de peito de frango apresenta contaminação por Salmonella Typhimurium, sendo necessária a retirada imediata do lote de circulação.