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VARIANTES DA PCR, ALUNA: Bruna Cardozo Rodolfo - Coggle Diagram
VARIANTES DA PCR
PCR
in situ
Realizado no local da fita molde
Duas formas de detectar
Direta
Utiliza nucleotídeos marcados
Indireta
Adiciona uma sonda marcada
PCR EM TEMPO REAL
Permite que a amplificação seja detectada automaticamente a cada ciclo.
Moléculas/ensaios fluorescentes para detecção em tempo real
Ensaio 5’-nuclease TaqMan®TM
Atividade 5’-nuclease da Taq polimerase
Degrada DNA que está à frente da síntese de DNA
Usa sondas que possui 2 moléculas fluorescentes
SYBR® Green
Corante fluorescente de detecção não específica
Curva de Melting
É a T onde 50% dos produtos formados vão se dissociar
Quando a amplificação e Threshold se encontram é possível observar a fluorescência
Aplicações
Teste em alimentos
Análise de Expressão Gênica
Diagnóstico de Doenças e Acompanhamento
PCR RAPD
Random Amplification of Polymorphic DNA
Amplifica a sequência de vários indivíduos para procurar polimorfismo
PCR RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
A variação do nucleotídeo pode ocorrer dentro de um sítio de restrição ou pode criar um onde antes não havia
Conhece a sequência
Procura polimorfismo
PCR AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
Técnica utilizada para detectar polimorfismos quando nenhuma informação é conhecida sobre o genoma que se quer estudar
PCR MULTIPLEX
Amplifica mais de um fragmento por vez
Economiza DNA, tempo e reagente
As sequências não podem ser complementares e apresentam a mesma Tm
PCR DE COLÔNIA
Identificar se o DNA exógeno se ligou ao vetor
Presença ou ausência do inserto
Orientação correta do inserto
Desenho dos primers
PCR
Touch Down
Aumentar a especificidade da detecção
Muda a temperatura de anelamento
Primeiro: aumenta a Tm
Menos primers se liga - aumenta especificidade
Segundo: abaixa gradualmente a T
Menos produtos - mais específico
PCR ALELO ESPECÍFICO
Amplificação seletiva de um determinado alelo
Para o conhecimento da sequência e da alteração
Determina homo/heterozigoto
PCR ASSIMÉTRICO
Usada para amplificar preferencialmente uma das fitas do DNA molde em detriment da outra
Não amplifica de maneira exponencial
Coloca excesso ou ausência de um primer
Utilizado no sequenciamento e hibridização
PCR
Hot Start
É utilizada para reduzir amplificações não específicas
Evita produtos não específicos
Pode ser feito
Manualmente
Barreira física
Proteínas acessórias
Isso faz a Taq DNA polimerase ser ativada em outras temperaturas
PCR inverso
Identificar material genético adjacente a uma sequência conhecida
Orientação reversa dos primers
Utiliza enzima de restrição (6 – 8nt)
Utilizado no sequenciamento e alinhamento
PCR NESTED
É utilizada para aumentar a sensibilidade e/ou especificidade
Tira a chance de ter falsos negativos
São realizadas duas reações consecutivas
São utilizados 2 pares de primers diferentes
PCR
LONG AND ACCURATE
Utilizado em sequências muito longas - alta processividade
Utiliza a expressão de proteínas com regiões codificadoras muito longas
Combina duas polimerases - uma com alta processividade e com com atividade 3’-5’ exonuclease
Isso permite a amplificação de até 40 kb
PCR SSLP
Simple Sequence Lenght Polymorphism
Detecta outros tipos de polimorfismos
Nada diferente da PCR convencional
ALUNA: Bruna Cardozo Rodolfo