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PCR convencional, RT PCR, PCR EM TEMPO REAL, Molécula que tem afinidade a…
PCR convencional
PCR RFLP
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A variação do nucleotídeo pode ocorrer dentro de um sítio de restrição ou pode criar um onde
antes não havia
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PCR HOT START
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manual, com barreira física ou proteínas acessórias
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PCR MULTIPLEX
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economiza tempo, reagente e amostra
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PCR RAPD
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sequência iniciadora única, pequena e arbitrária
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RT PCR
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- random primer 2. oligo(dT) primer 3. primer sequencia especifica
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- Molécula que tem afinidade a molécula de dupla fita de DNA, emite fluorescência bem baixinha quando -está em solução, no entanto, quando essa molécula que ta em solução encontra um dna dupla fita que ela pode se ligar, ela vai se ligar e nesse processo de associação ela muda de conformação e nesse processo de mudar de conformação ela emite a fluorescência
- Conforme a pcr vai acontecendo, vai aumentando a quantidade do alvo la dentro, consequentemente vai aumentar a quantidade de SYBR associado a molécula de dna, consequentemente, tem um aumento da fluorescência
pode se ligar a qualquer dna de fita dupla, ela pode se ligar no seu alvo e em outros lugares tbm, emitindo fluorescência para os 2, não dando pra identificar qual é qual, não sendo um tipo especifico
- Pode emitir diferentes comprimentos de onda (várias cores)
- Alem dos primers, tem a ligação de uma sonda específica chamada TaqMan para o seu alvo
- Ligado a 5’ tem o corante repórter: que é um agente fluorescente que será utilizado para detectar a amplificação do alvo; ela que gera a fluorescência, ela que vai falar que o fragmento alvo está sendo amplificado
- Na outra extremidade (3’) tem o quencher: molécula que “inibe” a fluorescência do repórter
- Se a repórter e o quencher estão próximos ocorre uma troca de energia, quando a sonda TaqMan está intacta, a fluorescência do repórter não vai para o meio, ela é absorvida pela molécula quencher // e quando estão longe, a emissão do corante verde é absoluta
- A sonda se liga em só 1 dos fragmentos (1 fita só) e se liga antes dos primers
- Com os primers e a sonda ligados de maneira especifica, aí a dna polimerase começa a add nucleotídeos // a fita sem o sonda amplificou normalmente, já a outra fita com a sonda, a dna polimerase add os nucleotídeos de maneira complementar e aí ela encontra um intruso (a TaqMan), então essa dna polimerase utilizada com sonda TaqMan tem a capacidade de pegar a estrutura 5’ (repórter)livre a frente dela e quebrar, separando essa sonda, deixando o repórter longe do quencher e a troca de energia que acontecia, deixa de acontecer e a fluorescência quer era absorvida não esta mais sendo, e o repórter passa a emitir fluorescência para o meio essa luminescência so foi gerada quando uma molécula de DNA foi formada, sendo proporcional a quantidade de dna que foi gerado e aí a fita continua sendo formada e passa para o próximo ciclo da PCR várias vezes
- a quantidade de DNA alvo que duplica a cada ciclo funcionando em seu potencial máximo, analises quantitativas
- onde a pcr perde eficiência, quase não há amplificação de dna alvo, escassez de reagentes e acumulo de subprodutos, ponto de detecção dos produtos (analise do produto final), análise qualitativa