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Cellules souches embryonnaires pluripotente - Coggle Diagram
Cellules souches embryonnaires pluripotente
Introduction
Définitions
Première cell totipotente : fusion gamète mâle et femelle formant zygote → organisme complet. Perte toti pdt division, variable selon espèce
cSE pluri : capacité à générer tous les tissus adultes
Tératome : ensemble de tissu qui illustre les 3 feuillets embryonnaires → cellules différenciées à un endroit inapproprié
Test totipotence : implantation cell dans blastocyste → chimère et vérif de sa descendance →
totipotence reproductive
hPSC
: cS pluri de Mamm.
embryon pré-implantatoire → cSE
embryon post-implantatoire → EpiSC
PGC → cGE
cellules somatiques modifiées → cS pluri induites = iPSC &
SCNT = somatic cell nuclear transfert
Totipotence cellulaire
: cell capable de se différencier en tout type cellulaire
cSE naïve (dérivée de la masse interne) et celles de l'épiblastes sont dites engagées
Etablissement des cellules souches embryonnaires
Isolation cell de la masse interne d'un blastocyste sans le trophoblaste : culture sur fb irradiées (cell nourricières qui ont arrêtées de se diviser) avec milieu DMEM + FBS + glutamine + B-mercaptoéthanol + AA non essentiels → dissociation cell non complètes → amas de 50-100 cell → remise en culture → colonies uniformes (et non amas) → repiquage sur cell nourricières → lignée cellulaire dérivée du blastocyste
Caractérisation cell dérivées indifférenciée
Rapport nucléo-cytoplasmique élevé
Nucléole proéminent
Caryotype normal
H9 cultivée plus de 8 mois (32 passages)
Activité télomérase élevée → maintien prolif
Marqueurs spé
de surface :
SSEA4
,
TRA
-1-60 (Tumor Rejection Antigen)
enzymatiques : phosphatase alcaline, télomérase
transcriptionnels : Oct3/4, Nanog, Sox2 …
Dif° spontanée in vitro
En abs de cell nourricières +/- LIF
En sub-confluence +/- cell nourricières (confluence = tapis cellulaire au max)
Cell H9 après 2sem : présence d’
α-fetoprotéine
et d’hCG
= différenciation en endoderme et trophoblaste
Données complémentaires
absence de point de contrôle en G1
hypométhyl° des promoteurs Oct4, SOX2, Nanog (hECG)
capacités de réparation de l’ADN
Différence des facteurs : LIF et BMP4 chez souris / Activine A, nodal et FGF chez H
Noggin
: inhibiteur voie BMP4
cES dérivée de l'épiblaste (post-implantation)
Culture
Milieu + Activine A + FGF2 → lignée EpiSC (souris et rat)
Exp° Oct4 ncssite activine (et non BMP4) chez le rat
Transcriptome = exp° globale des gènes → groupe distinct des cell → blastomère natif ou dérivé (cSE), épiblaste natif ou dérivé (EpiSC)
Dif° in vitro
Milieu sans sérum : neurone et astrocytes (Beta-III-tubuline, prot acide gliale fibrillaire)
Milieu avec FBS : cardiomyocytes (troponine T et Nkx2,5) et muscle strié (nébuline)
Souris chimère : - de 1% → cell dérivées au bout de 5jr de dév ne permet pas chimère car pluripotence engagée et non naïve
Voies de signa diff
cSE : LIF
EpiSC : activine et nodal
cSE humaines ressemblent + aux EpiSC de souris que cSE de souris
Pluripotence naïve et engagée
Etat naïf = fondamental
= capacité à former toutes les lignées embryonnaires y compris PGC et donner des chimères
mESC
Fct en + de Oct4, Nanog et SOX2 : Klf2 et Klf4
Marqueurs : Rex1, Fgf4 (...)
Prom Oct4 : distal
Respiration : phospho oxydative, glycolyse
Méth° globale de l'ADN : hypo
Culture in vitro : colonie bombée, colonie clonale
Culture 2i/LIF (2 inhibiteurs) : autorenouvellement
Culture EGF/Erk : dif°
Etat engagé
= stade + tardif de pluripotente où cell sont engagées vers lignée des 3 feuillets et perdent capacité à donner des chimère
hESC avec pluri plus faible et mEpiSC
Marqueur de spécification : Fgf5
Prom Oct4 : prox
Respiration : glycolyse
Méth° globale de l'ADN : hyper
Culture : colonie plate
Culture 2i/LIF (2 inhibiteurs) : dif°
Culture EGF/Erk : autorenouv
Conditions de culture et voies de signa
Voie Wnt : maintien pluri des cS. Inhibée par
GSK3
(active en état engagé).
CHIR
: inhibiteur GSK3
mESC
Milieu LIF + BMP4 (inhibe MEK) + inhibiteurs GSK, Erk et FGF-R (3i) → cell indif exprimant Oct4 (+ efficace que 2i)
Act° MEK/Erk : dif°
bEGF/Activine A : pluri engagée
mEpiSC +2i/LIF + surexp° Klf4 → pluri naïve
Chez Primates : pluripotence hESC maintenue par FGF2 et Activine A et aussi IGF/PI3K/AKT
