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Desarrollo del estudio metagenómica en virus, bacterias, protozoos en agua…
Desarrollo del estudio metagenómica en virus, bacterias, protozoos en agua de riego
Recolección y preparación de la muestra
Fuentes de agua de riego
Agua Regenerada
Convecionales
Agua potable
Agua de embalse
Agua subterránea
Agua de río
Aguas residuales
Referencia de la contaminación microbiana
Protocolo de floculación de leche desnatada (SMF)
Se ajustó el pH a 3,5 y la Conductividad eléctrica a 1,5 mS / cm² de las muestras
Se agregó PSM (Leche desnatada prefloculada) a las muestras con un concentrción de 0.01% de leche desnatada en la mezcla
Agitación de muestras durante 8 h a temperatura ambiente y los flóculos se dejaron sedimentar por gravedad 8 h más
Los sedimentos se centrifugaron 30 min a 4 °C
Los gránulos se suspendieron en 5 ml de tampón de fosfato a 0,2 M y pH 7,5
Método sencillo y de
bajo coste que sirve para concentrar virus en todo tipo de muestras de agua
Muestras de agua y aguas residuales
Análisis bioinformático y amplificación pre-NGS de ADN y ARN viral
Los concentrados se filtraron y se decartó el ADN libre y no viral
Se extrajeron ácidos nucleicos de origen viral
Se aplicó amplificación de un solo cebador independiente de la secuencia SISIPA
Los ácidos nucleicos se retrotranscribieron y etiquetadas con el primer A aleatorio para la detección de virus de ARN y ADN
PCR con AmpliTaq Gold Master Mix y primer B para obtener generar las bibliotecas
Los productos de la PCR se limpiaron y concentraron en volúmenes más pequeños
Cuantificación mediante el fluorómetro Qubit 2.0
Las muestras se secuenciaron en una plataforma Illumina MiSeq, 2 × 300 pb (lecturas de extremos emparejados)
NGS de poblaciones de
Protozoos
Se lisó un volumen de 300 μl de cada concentrado de SMF
El ADN se extrajo, siguiendo un protocolo modificado para el paso de lisis.
Las muestras se homogeneizaron 60s, se colocaron en hielo durante 1 min, lluego se homogeneizaron 60s más
. Los productos finales de ADN se extrajeron en un volumen final de 50 µl.
Región V4 del gen de ARNr 18S
Bacterianas
El ADN total se extrajo de 300 µl de los concentrados SMF
Las secuencias del adaptador de proyección se agregaron al cebador específico del locus para la región objetivo
Secuenciación de amplicones para
Protozoos
Bibliotecas de extremos emparejados y se secuenciaron 2 × 250 pb en una plataforma Illumina MiSeq
Las lecturas finales:
Las lecturas obtenidas se analizaron con QIIME 1.9.1, aplicando scripts adicionales .
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Calidad Phred superior a Q30, recortadas con QIIME 1.9.1 y limpiadas.
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Bacterias
Región V3-V4 del gen de ARNr 16S
Estadísticas y mapas de calor
Los índices de riqueza y diversidad
Estimación de riqueza de especies (Chao1):
diferentes especies detectadas
Índice de diversidad de Shannon:
las abundancias relativas de las especies presentes en una muestra
Software Catchall versión 4.0
Los mapas de calor
se generaron utilizando los gráficos ggplot2 de la biblioteca R
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