Etapas = Escolher o gene ➔ Escolher o vetor apropriado (ex: plasmídeo) ➔ Isolamento e digestão do DNA (escolha as 2 enzimas, veja onde cortam, abra o plasmídeo e corte o gene) ➔ Ligação dos fragmentos no vetor (usando ligases) ➔ Transformação bacteriana (tornamos a célula quimicamente competente para o vetor, onde centrifugamos o meio de cultura, pegamos o precipitado, re-suspendemos em tampão rico em cálcio, em um tubo colocamos o plasmídeo e bactéria, incubamos em gelo por 30 minutos e damos um choque térmico)➔ Seleção dos clones recombinantes (colocamos em cultura com um ágar seletivo com o antibiótico que o plasmídeo inserido possui resistência, matando as que não aceitaram o plasmídeo).
Preocupações = Na hora de escolher a enzima dê preferência a uma que o término do sítio coincida com o término do códon (se não teremos de acrescentar NT no primer para impedir tradução errada); Sempre vise usar 2 enzimas (para permitir que o plasmídeo não se feche e evitar que o gene de interesse seja inserido ao contrário), escolhendo a mais próxima do promotor para o primer forward (se precisar); Se o gene não tiver regiões de corte, crie um primer com pontas que a contenham e rode um PCR; Não escolha enzimas de restrição que corte o gene no meio; Caso acrescente terminações ao primer, cheque o sentido de leitura que a enzima corta.
Dica = Ao citar o nome da enzima, não esqueça que o final é número romano.