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DNA DAMAGE AND REPAIR E CLONAGGIO - Coggle Diagram
DNA DAMAGE AND REPAIR E CLONAGGIO
mutazioni
enzimatiche
avvengono durante la replicazione del DNA
citidina deaminasi
deaminazione di citosine
formazione di uracile
ADAR
deaminazione dell'adenina all'inosina
apolipoproteina B
formano lipoproteine
modalità di trasporto dei lipidi
Apo-B-100
proteina non editata
Apo-B-48
editing nell'Apo-B-100
editing nell'intestino
non enzimatiche
spontanee
deaminazione delle basi
quella della citosina forma l'uracile
nell'adenina genera l'ipoxantina
nella guanina genera la xantina
perdita di una base
molto comune per le purine, in particolare la guanina
single strand DNA breaks
causate dai ROS
double-strand DNA breaks
causate dai ROS
cambiamento di basi
transversioni
da purina a pirimidina o viceversa
transizioni
da purina a purina o da pirimidina a pirimidina
alchilazioni
es aggiunta di un gruppo metile
SAM
agente alchilante endogeno
formato da una metionina attivata
donatrice di metili
dimetilnitrosammina
nitrogen mustard
dimetilsolfato
O-6-metilguanina
causa mutazioni perchè si associa alla timina
eliminata dall'enzima MGMT
thymine dimers
legami covalenti tra due timine adiacenti
distorsione dell'elica
un kink
favorito dai raggi ultravioletti
favorite da agenti chimico-fisici mutageni
nitrosammine
agenti deaminanti
potenzialmente carcinogenici
ROS
anione superossido
ruba elettroni
radicale idrossile
ruba elettroni
perossido d'idrogeno
causano la rottura di una o di entrambe le eliche
causa ossidazione
8-idrossi-deossiguanosina
marcatore di radicali liberi
causato da stress ossidativo
marker di carcinogenesi
analoghi delle basi
agenti intercalanti
assomigliano alle basi
si intercalano tra le basi
causano mutazioni durante la replicazioni
meccanismi di riparo
fotoriattivazione
batteri
grazie alla fotoliasi
rompe legami creati da raggi UV
mismatch
avviene subito dopo la replicazione del DNA
ripara gli errori commessi dalla DNA polimerasi
proteine
MutL
richiama il MutH
negli eucarioti è MLH1
MutH
taglia a sinistra di una sequenza GATC
MutS
riconosce il danno
negli eucarioti è MSH2 o MSH1
mutazioni causano il cancro al colon
base excision repair
avviene quando si perde il legame tra la base e lo zucchero e si crea uin sito apurinico
bisogna sostituire il nucleotide
può essere usato quando c'è la deaminazione della citosina
usa le glicosilasi
8 tipi nell'uomo
nucleotide excision repair
proteine nei batteri
UvrC
fa due tagli
8 basi upstream del sito di taglio
UvrD
rimuove l'oligonucleotide
elicasi
UvrB
riconosce la mutazione
recluta UvrC
denatura il DNA nel punto dove si trova la mutazione
UvrA
riconosce la mutazione
per riparare i dimeri di timina
proteine uomo
da 20 a 30 proteine
apre localmente la doppia elica
incide il filamento danneggiato su entrambi i lati della lesione
riconoscono il danno
rimuove l'oligonucleotide
2 tipi nell'uomo
Global Genome-NER
nel DNA
Transcription Coupled-NER
durante la trascrizione
malattie
sindrome di Cockayne
ritardo della crescita
Trichothiodystrofia
capelli fragili e cheratina debole
xeroderma pigmentoso
ipersensibilità alla luce
autosomica recessiva
impossibilità di correggere i dimeri di timina
homologus recombination repair
può avvenire solo in fase S o G2
proteine coinvolte nella ricombinazione omologa
BRCA1
proteine nucleari coinvolte nella stabilità genomica
evitano mutazioni, traslocazioni e problemi a livelli di divisione del DNA
BRCA2
proteine nucleari coinvolte nella stabilità genomica
evitano mutazioni, traslocazioni e problemi a livello di divisione del DNA
interagisce con Rad51
la recluta a livello delle mutazioni
Rad51
importante per appaiare i cromosomi e per la ricombinazione omologa
malattie
Werner
invecchiamento precoce
predisposizione al cancro
mutazione del gene WRN
Rothmund-Thomson
portano ad un invecchiamento precoce
Bloom
portano ad un invecchiamento precoce
transletion synthesis
interviene quando le mutazioni bloccano la polimerasi
si usano polimerasi a bassa fedeltà
non homologus end joining
interviene quando avvengono rotture a singola o doppia elica
viene degradata la parte danneggiata del DNA
sistema mutagenico perchè si perde una parte di DNA
dimero Ku70/80
riconosce il danno e si lega al doppio filamento
plasmidi
DNA circolari dell'ordine di migliaia di coppie di basi ( 5mila-10mila)
replicano autonomamente in una cellula batterica
DNA extra-cromosomale
possono formare molecole chimeriche
conferiscono resistenza agli antibiotici
utilizzato per creare DNA ricombinante con DNA eucariotico
DNA eucariotico tagliato con un enzima restriction endonuclease
presentano una sequenza di riconoscimento
sequenze palindrome
costituite da 6 paia di basi
si mettono a cavallo dell'elica e riconoscono specificatamente una sequenza
tipi di taglio
simmetrico
taglio che genera estremità piatte
sfalsato
estremità appiccicose complementari una con l'altra
es. enzima EcoRI
deriva da escherichia coli di ceppo R
nucleasi scoperta di tipo I
sequenza G/AATTC
sopportano l'inserto di 10mila paia si basi
solitamente ci si limita a 2-3 mila
caratteristiche
diversi siti di restrizione
le regioni che contengono più siti sono dette poli-linker
origine di replicazione
punto esatto in cui inizia la replicazione del DNA
resistenza ad un antibiotico
così si possono selezionare le cellule con il plasmide
espressione di una proteina ricombinante
neccessita di
introduzione del gene
sito di legame al ribosoma
sequenza di Shine e Dalgarno
sequenza di terminazione
essenziale per la terminazione della trascrizione
origine di replicazione
operatore
controlla il promotore
polylinker
dove può essere inserito il frammento
deve contenere il ribosome binding site
promotore
marker di selezione
sequenziamento
southern blotting
ricercare un particolare frammento di DNA
tutti frammenti di DNA genomico tagliato con enzimi di restrizione
filtro di nitrocellulosa
isotopi radioattivi come sonda
proteine
acrilammide
migrazione elettrica
miscela con SDS ( sodio dodecilsolfato)
coomassie
blu
elettroforesi
gel di agarosio
100 Volt
bromuro di etidio
intercalante del DNA
fluorescenza di colore rosso-arancione
western blotting
trasferimento tramite elettricità
filtro per elettricità
2 anticorpi
primo specifico per la proteina
secondo specifico per il primo
legato ad un enzima per identificarlo
metodo di Sanger
utilizza un dideossinucleotide
nucleotide che non ha ossidrili in posizione 2' e 3'
si formano frammenti di diversa lunghezza
diverse lane
automatizzato
viene inserto un nucleotide fluorescente
ogni dideossinucleotide è legato ad un fluoroforo diverso
una sola lane
Ion Torrent
viene identificato il protone durante l'incorporazione del nucleotide
quando si libera fa variare il pH
variazione rilevata in micropozzetti
PCR
inizio anni 80
amplificazione esponenziale
fasi
annealing
55°C - 65°C
i primer si appaiano con lo stampo
30 secondi
sintesi
72°C
durata variabile a seconda della lunghezza del DNA
denaturazione
95° C
1 minuto
i filamenti si separano
termocycler
componenti
deossiribonucleotidi
substrati della polimerasi
tampone
miscela di sali
cloruro di magnesio
primers
oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti
enzima
Taq polimerasi
stampo di DNA
vantaggi
analisi simultanee di molti campioni diversi
analisi simultanee di diverse sequenze sullo stesso campione
rapidità
analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani
sensibilità
svantaggi
conoscenza delle sequenze da amplificare
sintetizzare frammenti relativamente corti
variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza
sintesi imprecisa con introduzione di errori
contaminazione di falsi-positivi
utilizzi
clonaggio e manipolazione dei geni
mutagenesi
produzione di sonde
tipizzazione dei geni
analisi di campioni biologici
PCR in real time
possibile vedere la quantità dei prodotti durante il ciclo
utilizzo di una molecola intercalante
SYBR Green
fluorescente
fasi
annealing
inizio fluorescenza
allungamento
intensità di fluorescenza alta
denaturazione
no fluorescenza
paragone dei campioni
treshold
si traccia una linea dove si vuole osservare
Cq
punto di intercettazione della linea
Cq<29
acido nucleico originale era molto abbondante
30< Cq< 37
target era in quantità moderate
Cq>38
quantità infinitesima di target e contaminazioni