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Enzimas Modificadoras do DNA, Rompem ligações fosfodiéster - Coggle Diagram
Enzimas Modificadoras do DNA
Endonucleases
(enzimas de restrição)
Sítios específicos (palindrômicos);
Isoladas de ≠ bactérias.
EcoRI
5' G
AATTC
3'
5' overhang
MENOR ENERGIA
Visto que a extremidade coesiva leva a uma região de complementariedade com a outra fita, esta é religada muito mais facilmente através das pontes de hidrogênio. Já a extremidade cega necessita de fatores que favoreçam a ligação, como a diminuição da temperatura, diminuindo o grau de agitação das moléculas e aumentando as chances de se encontrarem/aproximarem; além de precisar de um maior tempo de incubação e uso de uma concentração maior de enzimas (com mais reagentes, pois nesse caso é necessário a ação de uma Ligase para fazer a ligação fosfodiéster).
Pstl
5'
CTGCA
G 3'
3' overhang
Pvull
5' CAG
CTG
3'
extremidade cega
MAIOR ENERGIA
Chance de achar a sítio:
1/4n
Exonucleases
Extremidades 5' e/ou 3'
Não agem em plasmídeos
Uso em laboratório para destruir plasmídeos rompidos nos processos de pipetagem, por ex.
BAL 31:
Ação em 5' e 3'
tempo dependente
DNAdf
Exonuclease III:
Ação em 3'
Ligases
Ligação entre -OH e -P
Fosfodiester
Polimerases
DNA pol I
Domínio exonuclease 3'-5'
reparo
Domínio exonuclease 5'-3'
retira primers/sondas
Domínio polimerase
add nt
Fosfatases
catalisa remoção de P 5'
Tratamento de vetor digerido antes de sua ligação com inserto
DNA recombinante em plasmídeos
Quinases
Transferem gama fosfato do
ATP para extremidade 5'
Preparo do DNA para a ligação;
Marcação c/ 32P gama como doador
T4 polinucleotídeo quinase
Necessitam de:
Tampão (Tris, HEPES, etc);
Sal;
Íons divalentes;
Glicerol;
EDTA.
Rompem ligações fosfodiéster