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Extracción de ácidos nucleicos - Coggle Diagram
Extracción de ácidos
nucleicos
La molécula de ADN con independencia de la estabilidad química dada por su estructura helicoidal.
entre más larga la
molécula, más débil la fuerza requerida para esta rotura
es físicamente frágil, por ser larga,
tortuosa y con un peso molecular alto
Fuente del ácido nucleico
En teoría el ADN/ARN se obtiene de cualquier célula/ virus que lo contenga, los eritrocitos no contienen ese material genético ya que son anucleados.
Las fuentes posibles de material para la extracción de los ácidos
nucleicos
•Disolución.
•Lavado
•Precipitación
•Purificación
•Separación
•Lisis de la célula
Elección del método de extracción
La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la mayoría de estudios en biología molecular
Tipo de ácido nucleico que se va a extraer:
ADN de cadena sencilla (ADNss)
DNAds
ARN total
ARN mensajero (ARNm) o ARN ribosomal (ARNr)
Organismo origen del ácido nucleico:
-mamíferos
-plantas
-procariotas
-virus
Fuente del ácido nucleico:
cultivo celular
tejido (generalmente biopsia)
sangre (leucocitos)
expectoración
suero
orina
líquido cefalorraquídeo
Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído:
retro transcripción
PCR
clonación
Northern blot
Southern blot
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo
Esto deja al ADN puro listo para su separación por precipitación en soluciones alcohólicas.
Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes
Lisis de las células y liberación del ADN
El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes Triton o docedil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las membranas celular y nuclear
El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular
sin dañar el ácido nucleico.
La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y proteínas K
se libera el ADN de las histonas con las que se encuentra
empaquetado y proteoliza proteínas celulares
La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el caso del ADN
la homogeneización se lleva a cabo con un homogeneizador
manual para evitar la rotura mecánica de la molécula
Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purificación.
Los métodos de purificación de ácidos nucleicos combinan estrategias tan diversas como la extracción/precipitación
Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una
solución que tiene una relación 25:24:1 v/v para el fenol, cloroformo,
alcohol isoamílico.
se añade hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, un inhibidor parcial de ARNsas
Precipitación de ADN
El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico)
los ácidos nucleicos son
insolubles en soluciones alcohólicas.
al emplear IprOH puede acelerarse el proceso, con un tiempo de incubación menor, y la precipitación puede realizarse a temperatura ambiente
Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa
Lavado del ADN
El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones.
El contenido de alcohol de esta solución (70%) mantiene al ADN precipitado
el H2O (30%) permite
la disolución de las sales presentes.
Disolución del ADN y adición de ARNsa
después de la evaporación del alcohol, el botón de ADN se disuelve en soluciones que aseguren su preservación, omo agua estéril y libre de ADNsas, o bien soluciones amortiguadoras
La cantidad de solución para disolver el ADN debe ser mínima para mantener una concentración adecuada del ácido nucleico que permita su empleo en técnicas posteriores
El ADN se disuelve por pipeteo constante del botón hasta lograr una solución homogénea
Espectrofotometría
la espectrofotometría es que cualquier solución que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción inversa a la cantidad de moléculas que
contiene
Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción máxima a una
longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV)
490-530 nm
505 nm
un fotodetector mide la intensidad de luz absorbida.
Mientras más luz absorba la muestra (absorbancia) mayor será la
concentración de ácidos nucleicos.
Dilución: como se requieren volúmenes relativamente grandes de solución para cubrir la capacidad de las celdas de los espectrofotómetros, suelen manejarse diluciones 1:100 a 1:1000 del stock de ADN
Constante
50 para el ADNds
40 para ARN
33 para oligonucleótidos
37 para ADNss
μg/μl de AN = OD a 260 nm × Dilución × constante / 1 000
Cuantificación de los ácidos nucleicos
Existen diversos métodos de cuantificación de ácidos nucleicos; los
más usados son la espectrofotometría y la fluorometría.