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EXTRACCIÓN DE ADN kits1 - Coggle Diagram
EXTRACCIÓN DE ADN
Consideración para la extracción de ácidos nucleicos.
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Al pipetear, agitar o revolver el ADN se genera un flujo hidrodinámico que puede separar las dos cadenas de ADN; entre más larga la molécula, más débil la fuerza requerida para esta rotura. Por ello, obtener fragmentos de ADN genómico es fácil. : :star:
Fuente del ácido nucleico
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Se obtiene de cualquier célula o virus que lo contenga. Las fuentes posibles: :red_flag:
Lisis de la célula, separación, purificación, precipitación, lavado, disolución. :black_flag:
Espectrofometría
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En la celda un haz de luz atraviesa la solución de ácidos nucleicos , un fotodetector mide la intensidad de luz absorbida. :star:
Más luz absorba la muestra mayor será la concentración. :star:
490-530nm, 505 nm :star:
OD a 260 nm, absorbancia del ácido nucleico :star:
Nucleótidos de ADN Y ARN presentan la absorción máxima a una longitud de onda de 260 nm. :star:
Cualquier solución que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un has de luz. :star:
Dilución, :star:
1:100 a 1:1000 de stock del ADN :red_flag:
Solución en fosfato de sodio dibásiico, 1.5 uM a pH 5.2 (Na2HPO4), para leer los nucleótidos sin interferencia. :red_flag:
Elección del método de extracción.
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Primer paso ante cualquier estudio molecular y en técnicas del ADn
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Origen del ácido nucleico :red_flag:
Mamíferos, plantas, procariotes o virus :black_flag:
Fuente del ácido nucleico :red_flag:
Cultivo celular, tejido (biopsia), sangre (leucocitos), expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo. :black_flag:
Tipo de ácido nucleico: :red_flag:
ADNss, DNAds, ARNtot. ARNm,o ARNr :black_flag:
Técnica a utilizar el ácido nucleico extraído :red_flag:
Retrotranscripción, PCR, clonación, Northern blot, Southern blot : :black_flag:
Lisis de la células y liberación del ADN
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Extracción de la homogenización del tejido y la lisis con detergentes. El procedimiento es crítico y debe ser suficientemente agresivo, :star:
Disgregación del tejido y su homogeneización se lleva a cabo en el buff er de lisis. : :star:
Incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65C :star:
Lavado del ADN
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Alcohol de la solución (70%) mantiene el ADN precipitado. :star:
Alcohol del H2O (30%) permite la disolución de las sales. :star:
El botón de ADN que se obtiene en la precipitación se lava con etanol al 70% dos ocasiones. :star:
Disolución del ADN y adición de ARNsa
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La cantidad de solución para la disolver el ADN debe ser mínima para una concentración adecuada. :star:
El ADN se disuelve por pipeteo constante del botón hasta obtener una solución homogénea. :star:
Después de la evaporación dela alcohol, el bóton de ADN se disuelve en soluciones que aseguren su perseverancia. :star:
Precipitación de ADN
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Etanol (EtOH), la cantidad es dos veces el volumen de fase acuosa :star:
Isopranol (IprOH), se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa. :star:
El ADN disuelto en la solución se precipita con alcohol absoluto. :star:
Al emplear IprOH se acelera el proceso, con tiempo de incubación menor y precipitación en tun tiempo ambiente. : :star:
Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos :
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Proceso de purificación :star:
Los métodos de purificación combina estrategias; extracción/precipitación, cromatografía, centrifugación, electroforesis y separación por afinidad. :star:
Extracción con la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una solución 25:24:1 v/v para el fenol, cloroformo, alcohol isoamílico. :star:
Se añade hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, inhibidor parcial de ARNsas, quelante débil de iones metálicos. :star:
Constante
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Valor teórico de OD para cada ácido nucleico: :checkered_flag:
40 para ARN :red_flag:
33 para oligonucleótidos :red_flag:
50 para ADNds :red_flag:
37 para ADNss :red_flag:
Cuantificación
de los ácidos nucleicos
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Espectrofometríaa y fluorometría :star:
Extracción del ADN por la técnica fenol-cloroformo
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Lisis total de las células y sus estructuras subcelulares. :star:
ADN puro y listo :star:
