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Extracción de ácidos nucleicos - Coggle Diagram
Extracción de ácidos nucleicos
Consideración para la extracción de ácidos nucleicos:
La molécula de ADN con independencia de la estabilidad química dada por su estructura helicoidal
Al pipetear, agitar o revolver el ADN se genera un flujo hidrodinámico que puede separar las dos cadenas de ADN; entre más larga la molécula, más débil la fuerza requerida para esta rotura. Por ello, obtener fragmentos de ADN genómico es fácil, pero conforme se requieran tamaños moleculares elevados (> 150 kb) la técnica se dificulta.
Elección del método de extracción:
Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena sencilla (ADNss), DNAds, ARN total, ARN mensajero (ARNm) o ARN ribosomal (ARNr).
Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procariotes o virus.
Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido (generalmente biopsia), sangre (leucocitos), expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.
Fuente del ácido nucleico:
En teoría el ADN/ARN puede obtenerse de cualquier célula/ virus que lo contenga; solamente los eritrocitos no se consideran una fuente de ADN/ARN, ya que son anucleados.
Las fuentes posibles de material para la extracción de los ácidos nucleicos
Precipitación de ADN
El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas
Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa, mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa
Por otro lado, al emplear IprOH puede acelerarse el proceso, con un tiempo de incubación menor, y la precipitación puede realizarse a temperatura ambiente
Lavado del ADN
El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones. El contenido de alcohol de esta solución (70%) mantiene al ADN precipitado, y el H2O (30%) permite la disolución de las sales presentes.
Cuantificación de los ácidos nucleicos
Existen diversos métodos de cuantificación de ácidos nucleicos; los más usados son la espectrofotometría y la fluorometría.
Espectrofotometría
Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción máxima a una longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV); por lo tanto, los espectrofotómetros son los aparatos más utilizados para determinar la concentración de ácidos nucleicos en solución.
El fundamento de la espectrofotometría es que cualquier solución que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción inversa a la cantidad de moléculas que contiene.
490-530 nm
505 nm
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo
Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos
Esto deja al ADN puro listo para su separación por precipitación en soluciones alcohólicas.
Lisis de las células y liberación del ADN
El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes (Triton o docedil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las membranas celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido nucleico.
La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buff er de lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el ADN de las histonas con las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares.
La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el caso del ADN, la homogeneización se lleva a cabo con un homogeneizador manual para evitar la rotura mecánica de la molécula; para el ARN se emplea un homogeneizador eléctrico que gira a unas 200 a 1000 rpm.
Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purificación
Los métodos de purificación de ácidos nucleicos combinan estrategias tan diversas como la extracción/precipitación, la cromatografía, la centrifugación, la electroforesis y la separación por afinidad
Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una solución que tiene una relación 25:24:1 v/v para el fenol, cloroformo, alcohol isoamílico.
generalmente se añade hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, un inhibidor parcial de ARNsas, quelante débil de iones metálicos, y que ayuda a identificar la fase orgánica por el color amarillo que le confiere.
Precipitación de ADN
El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas.
Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa, mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa.
Por otro lado, al emplear IprOH puede acelerarse el proceso, con un tiempo de incubación menor, y la precipitación puede realizarse a temperatura ambiente