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Klebsiella Pneumoniae 04643/04644 Purification & Crystallization, 정제…
Klebsiella Pneumoniae
04643/04644
Purification & Crystallization
Target information
특이사항
Toxin이 강한 dimer를 이룸으로써 전기영동 끌림.
Kpn04643
Antitoxin
MW : 9.046
pI : 8.15
RelB
Kpn04644
Toxin
MW : 11.156
pI : 9.85
RelE
Complex
MW : 22.478 / 20.183 (THR)
pI : 9.68 / 9.60 (THR)
E : 22.92
Complex
Purification
Ion exchange chromatography
pH6, 20mM MES, 100mM NaCl
농축으로 buffer change 안됨.
peak 엄청 더러움. 마지막 peak 모아서 진행.
pH7, pH7.5, 20mM HEPES, 100mM NaCl도
peak는 간결해지나 별 차이 없음.
Thrombin은 20℃ overnight 진행.
Size exclusion chromatography
pH6 - 8.5까지 buffer 다 test 해봄
Tag 자르기 전 후 다 진행해봄.
전체적으로 끌리는 건 동일.
SEC에서의 큰 차이는 없음.
His-tag chromatography
pH7.9, 20mM TRIS A, B buffer
Steps (1L)
Loading, Wash 50mM A+B (200ml),
Elution (100~500mM)
전기영동 상에서 toxin 위치가 끌림. 강한 dimer예상
Heating, Non heating 전기영동 다름. Heating 했을떄 잡band가 심해짐...
Crystallization
Thrombin X
4℃, 20℃ 모든 조건 screening 했으나 Hit X.
Thrombin O
초기 screening 결과
Peg,Ion E8 / 6Å
정도 나타남
다양한 조건을 screening 하며 많은 Hit optimize 함.
Diffract 결과 Low 함. 8~10Å
이때 생각으로는 전기영동 상의 잡 band 는 antitoxin 말단 부근 때문이다 생각. - Construct를 시도해보자.
DSF
가장 stable한 buffer 찾으려고 진행.
pH8.5 TRIS, pH7.3 ammonium sulfate
모두 screening 해봄.
결과는 그저..
Crystal Dehydration
Air dehydration, Hanging drop dehydration 시도
Crystal의 water를 제거하는것.
Air는 실패, Hanging drop은 큰 변화 없었음.
Construct
D10, M24, M49 진행
D10제외 나머지는 발현 안됨.
D10 마저도 큰 차이는 없었음.
Construct No tag, Toxin N tag도 진행해봄
발현 안됨
D10 Construct는 재 정제해서 Crystal 깔아보면 다를지도 모르겠다는 생각은 듦. 당시 screening은 큰 결과 없었음,
Duet
잡band는 Heating 차이인걸 앎....
SEC 끌림을 해결해보고자 Duet 진행.
발현량 일정해질 줄 알았으나 차이 X
Screening 결과 없음. Tag 제거를 못함.
다른 tag을 붙이려했으나 target 변경,
Kpn04643 단독
단독 샘플 진행함
E 값이 0이 아닌데 UV detect이 안됨.
다른 정제 없이 His-tag 후 buffer만 바꿔서 crystallization
Hit이 생겨서 optimize 후 포항
결과는 Low diffract. 오히려 SP 아메바 모양 crystal이 best 였음.
정제 순서 진행해본 것
His-tag - IEX - SEC
His-tag - IEX - Thrombin - SEC
His-tag - Thrombin - IEX - SEC