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Shigella dysenteriae 2257, 2258 Purification & Crystallization -…

- - - - pH9, 20mM CHES, 100mM NaCl
        
        pH8.5, 20mM TRIS, 100mM NaCl (차이 없음)
        
        Toxin 단독 pI랑 Complex pI 근접해서
        one peak
        
        20℃, 4℃ thrombin cutting X
        
        Main 모아서 SEC
    - - pH7.9, 20mM TRIS A, B buffer
        
        Steps (1L)
        Loading, Wash 50mM A+B (200ml), Elution (100~500mM)
        
        250 - 400mM 사용
        
        Loading 시 침전 많이 생김, elution시 감소
        
        발현량 많아서 그런듯. 조금만 깨도 충분함.
        
        Desalting 으로 buffer change 후 바로 IEX
    - - 모든 column (200, 75gl)에서 다 끌림
        
        최대한 앞쪽만 모아서 crystallization 진행.
  - - - Screening (Wiz1,2,3,4 / Index / Peg.Ion)
        
        pH8, 20mM TRIS, 200mM NaCl
        (4℃, 20℃) (0.3mM, 0.1mM)
        
        pH8, 20mM TRIS, 100mM NaCl (4℃, 20℃)
        
        pH7.5, 20mM HEPES, 100mM NaCl (4℃, 20℃)
    - - Screening (Wiz1,2,3,4 / Index / Peg.Ion)
        
        pH5, pH6.5, 20mM MES, 100mM NaCl 침전
        
        pH7.5, 20mM HEPES, 100mM NaCl, 10% glycerol (4℃, 20℃)
        
        pH 8. 20mM TRIS, 100mM NaCl, 10% glycerol (4℃, 20℃)
        
        pH 7.5, 20mM HEPES, 100mM NaCl, 200mM Immidazole(4℃, 20℃)
        
        pH 7.5, 20mM HEPES, 400mM NaCl.(4℃, 20℃)
- - - - SDY2257/2258
        
        SDY2999/3000
        
        SDY4142/4143
        
        SDY2199/2200
      - 진행 사항
        
        SDY2257/2258 정제 완료 (T-N, AT-N)
        
        SDY4142/4143 정제 완료 (T-N)
        
        SDY2199/2200 발현, Soluble
        But His tag 안걸림. Tag 위치 변경 필요
        
        SDY2999/3000 발현량 적음, Toxin 단독만 정제 가능예상
        
        Homologue 너무 많음
        
        Tag 위치 변경해서 complex 정제 가능하나 다소 merit 떨어질듯.
        
        Tag 변경
    - - SDY0072/0072
        
        SDY0251/0252
        
        SDY4460/4461