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Streptococcus Pneumoniae 1740, 1741 Purification & Crystallization,…

- - - - pH7.9, 20mM TRIS A, B buffer
        
        Steps (1L)
        Loading, 2M NaCl wash (<50/50>100ml), Wash 50mM A+B (200ml), Elution (100~500mM)
        
        Usally 250~350mM elution.
    - - pH8.5, 20mM TRIS, 100mM NaCl
        
        Steps
        Desalting buffer change, Loading,
        Wash(5%, 50ml), Elution(Usally one peak)
        
        Thrombin Cutting 500λ - 4λ (Concs - 0.4~0.6mM)
        Under 16~18hrs, 4℃ 진행, 20℃는 침전으로 Toxin 감소
    - - pH8.5, 20mM TRIS, 100mM NaCl
        
        Elution time (10.22 - 10.27ml)
        
        끌림, 앞쪽 Main 만 이용.
        
        Fractionation (UV 20이상, 0.5ml씩)
        2, 3 fraction 이용.
        
        Standard / 75kDa 보다 앞쪽. 예상
        ~80kDa.
    - - gl, pg 모두 다 끌림
        
        Cutting 후 진행
  - - - Crystal screening
        
        20℃
        
        Wizard 1, 2, 3, 4 / Index / Peg.Ion
        
        4℃ screening X
      - Crystal optimization
        
        Wizard 2, E10 (29)
        
        기존 시약 / 1:1, 1.5:1 (Ptn : Sol) - 3점 초반, 2.9 Å (P222)
        
        만든 시약 / Ratio 변화, Hanging drop, Additive, Detergent - 3점 초반, 2.7Å (C2)
        
        Index C5
        
        기존 시약 / 1:1, 1.5:1 (Ptn : Sol) - reproduce 확인
        
        만든 시약 / reproduce 되나 Crystal 상태가 안좋음. 안올림
        
        Wizard 4, G10
        
        기존 crystal 각지고 단단. 기존 시약 reproduce 오래 걸림
        
        Diffraction 제대로 못함.
- - - - pH7.9, 20mM TRIS A, B buffer
        
        Steps (1L)
        Loading, 2M NaCl wash (<50/50>100ml),
        Wash 25mM A+B (200ml), Elution (100~500mM)
    - - pH9, 20mM CHES, 100mM NaCl
        
        20℃ Thrombin cutting 진행
    - - 75gl 진행 / Thrombin cutting 안하면 엄청 끌림
        
        Cutting 시 one peak