Consiste en la fosforilación de la F6P en el C1, que rinde fructosa 1,6-bifosfato (F1-6P). En esta reacción, catalizada por otra quinasa, la fosfofructoquinasa (FFQ), se consume ATP. Esta enzima merece especial atención porque, como se mencionará más adelante, participa en la regulación de la glucólisis.