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TECNOLOGIE DEL DNA - Coggle Diagram
TECNOLOGIE DEL DNA
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IBRIDAZIONE
E' una tecnica che si basa sulla capacità di un filamento di DNA di appaiarsi con il complementare e formare la doppia elica
Una volta che è nota la sequenza di un certo gene, si preparano le sonde.
Sonde ➞ tratto di DNA a singolo filamento marcato con coloranti fluorescenti o radioisotopi
Il DNA viene tagliato, sottoposto a elettroforesi e denaturato (divisi i doppi filamenti). Viene poi posto a contatto con la sonda e dopo alcune ore si vede quali tratti si sono legati
MICROARRAY A DNA
Matrice con pozzetti che contengono molte copie di una diversa sonda di DNA a singolo filamento (probe), che consente di rilevare l'espressione di più geni in diversi tessuti contemporaneamente
Per eseguire la diagnosi dell'anemia falciforme (malattia genetica dovuta al cambiamento di un solo nucleotide CTC ➞ CAC) si preleva DNA dalle cellule fetali e lo si pone a contatto con 2 sonde radioattive
CLONAGGIO DI UN GENE
Inserendo il DNA ricombinante in un altro organismo si può far esprimere in esso la proteina estranea per cui il gene codifica
5 TAPPE:
- isolamento del gene
- inserimento del gene nel vettore ➞ DNA ricombinante
- introduzione del DNA ricombinante nella cellula ospite
- Clonaggio del gene ➞ proliferazione cellula ospite
- Recupero e purificazione della proteina
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I frammenti vengono tagliati con gli stessi enzimi di restrizioni, in modo che si formino estremità coesive, che poi vengono saldate dalla DNA ligasi, che crea legami fosfodiesterici
Il DNA ricombinante viene introdotto nella cellula ospite attraverso un plasmide o un batteriofago. All'interno del batterio esso si moltiplicherà velocemente e in questo modo è possibile ottenere in breve tempo da una singola cellula un numero enorme di cloni
Tra le prime proteine ottenute in questo modo vi sono gli interferoni, sostanze ad azione antivirale e antitumorale
PCR
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- Devono essere prodotti 2 oligonucleotidi, con la funzione di inneschi (primer), ciascuno complementare all'inizio e alla fine della sequenza
3 FASI:
- Denaturazione ➞ DNA riscaldato a 90° per separare i filamenti
- Ibridazione ➞ temperatura a 50° per far appaiare i primer
- Allungamento ➞ temperatura 60° per garantire la specificità della reazione, i primer non appaiati perfettamente si staccheranno. Le DNA polimerasi termoresistenti sintetizzano i filamenti
- Si riscalda di nuovo a 90° e si ricomincia
Oggi si conoscono le sequenze dei vettori di clonaggio e di conseguenza è possibile usare primer universali
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