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Métodos de purificación y secuenciación de ácidos nucleicos y proteínas -…
Métodos de purificación y secuenciación de ácidos nucleicos y proteínas
Purificación
Proteínas
Paso 2
Purificación intermedia
Diálisis
las sales de las proteínas serán conservadas pasando la solución a través de una membrana semipermeable
La diálisis no se puede utilizar para separar las proteínas de diversos pesos moleculares.
Salazón
Las proteínas en un extracto crudo son purificadas después precipitándolas en una solución de sal altamente concentrada
todas las proteínas no se precipitan en la misma concentración de sal, que significa que la salazón también ayuda a fraccionar las proteínas.
Cromatografía
Éstos están disponibles ahora como estuches preformados para muchas proteínas estándar
son a menudo convenientes para los procesos en grande
La cromatografía inversa se puede limitar en su uso debido a la desnaturalización posible de la proteína por los disolventes orgánicos
Paso 3
Purificación final
Electroforesis del gel de poliacrilamida
se utiliza para descubrir la pureza de la muestra de la proteína después de cada paso basado en la talla
La carga neta en la molécula hace que baja la olumna o la hoja del gel en un campo eléctrico
permitiendo separar las proteínas basadas en su velocidad de la migración, que a su vez depende de su carga
El gel actúa como filtro químicamente inerte y fácilmente formado
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Immunoblotting
es otra técnica útil combinada a menudo con cromatografía de afinidad
Utiliza los anticuerpos para que la proteína sea aislada como ligands en la olumna
El anticuerpo se sujeta a veces a los isótopos o a los tintes para etiqueta los y para hacer la detección más fácil después de la separación.
Cualquier técnica cromatográfica se perfecciona usando la presión para forzar la solución a través de una olumna de materiales fino divididos
Cromatografía de afinidad
Este proceso depende de usar los ligands limitados a las molduras que atan específicamente a la proteína del interés que se puede entonces enjuagar fuera con otra solución de ligands libres
Esto da lugar a las muestras extremadamente puras de la proteína que tienen la actividad específica más alta entre todas las técnicas de uso corriente.
ejemplo es la purificación de la concanavilina A usando los residuos de la glucosa sujetados a las molduras en una olumna.
Paso 1
Crear un extracto de la proteína cruda
Los extractos crudos de proteínas intracelulares son preparados lysing la célula usando procesos químicos o mecánicos.
Las proteínas extracelulares son obtenidas centrifugando la solución y quitando las células.
Método específico
calentar la mezcla para desnaturalizar otras proteínas, y después la enfría
finalmente centrifugándola para quitar las proteínas desnaturalizadas.
ácidos nucleicos
Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares
suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes
cromatografía
Técnicas
intercambio iónico
se basa en la interacción electrostática de la molécula diana con un
grupo funcional de la matriz en columna
Los ácidos nucleicos (polianiones lineales
con fuerte carga negativa)
pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico con
simples Tampones salinos
adsorción selectiva o unión por afinidad.
los ácidos nucleicos
se fijan selectivamente en sílice o vidrio
en presencia de determinadas sales
mientras que otras moléculas biológicas no se fijan
permeación
sobre gel
aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel
para tamizar moléculas
Se emplea una matriz con poros de tamaño definido
dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión
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extracción/precipitación
se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los
contaminantes de los ácidos nucleicos
ejemplo
suele emplearse una
combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas
separación por afinidad
simplifica la purificación de los ácidos nucleicos
sustituye las etapas de
centrifugación
Extracción inorgánica
separación de fases por
una operación de separación magnética
única y rápida
centrifugación
La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz
la ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g
elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos
suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna
centrifugada
se combina la permeación sobre gel y la centrifugación
para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños
como; sales, nucleótidos,
etc
Secuenciación
Proteínas
Secuenciación de péptidos
Se pueden secuenciar automáticamente
utilizando el reactivo Edman
Este separa el aminoácido N- terminal del resto del péptido
Se realizan ciclos automáticos de separación e identificación cromatográfica
Sanger
Las proteínas se pueden secuenciar al romperlas en péptidos
en un tamaño adecuado y separados por cromatografía
Los péptidos de un conjunto, tienen secuencias
solapan las de los péptidos del otro grupo y por comparación se puede establecer
para romperlas se utilizan enzimas, o bien reactivos conjuntos de péptidos.
Espectrofotometría de masas
es necesario ionizar dicho analito y pasarlo a fase gaseosa
Durante los próximos años, se irán completando los catálogos proteicos de diferentes condiciones celulares
ácidos nucleicos
Método químico de Maxam y Gilbert
Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla
marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases
Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven
por electroforésis
en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.
Métodos clásicos
Marcado
Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente
Separación
Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas
cuyos tamaños se diferencian en una única base
Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse
Por
electroforesis
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Método enzimático de Sanger
Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977
se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi
Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador
complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia.
Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO
empleando cebadores fluorescentes
Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una
de las cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas.
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo
empleando terminadores fluorescentes
Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs
cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta
