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ACIDOS NUCLEICOS Y PRUEBAS GENETICAS EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE…
ACIDOS NUCLEICOS Y PRUEBAS GENETICAS
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FUNDAMENTO TEÓRICO
A partir de 1953, cuando James D. Watson y Francis Crick reportaron el descubrimiento de la estructura molecular del ADN
El manejo de genes humanos ha permitido el estudio de la constitución genética del hombre, lo cual conduce a un mejor entendimiento de los factores que determinan las enfermedades de origen genético.
En el campo de la epidemiología molecular la utilización de secuencias específicas de ADN de los agentes infecciosos ha tenido gran impacto en el diagnóstico moleculares de las enfermedades infecciosas
El conocimiento del genoma permite utilizar genes específicos para la detección de organismos patógenos en distintos fluidos lo que ha generado el desarrollo de métodos más sensibles y confiables.
ESTRUCTURA
Los ácidos ribonucleico y desoxirribonucleico son las biomoléculas responsables de resguardar la información genética del organismo.
En el ARN de ribonucletidos tienen el azúcar ribosa, mientras que los desoxirribunucleotidos contienen el azúcar desorribosa.
Las bases nitrogenadas son las purinas adenina y guanina y las pirimidinas timina, citosina
y uracilo.
Se dice que el ADN es una doble hélice antiparalela porque:
Está formado por dos cadenas. (doble)
Se forman algunos puentes de hidrógeno en las cadenas que provocan que se plieguen formando una estructura helicoidal. (hélice)
La dirección de una cadena es contraria a la cadena complementaria; es decir, si en el extremo de una de las cadenas se encuentra el grupo OH del carbono 3’, entonces la cadena complementaria inicia con el extremo fosfato, es decir el extremo 5’.(antiparalela).
En los sistemas vivos existen otros nucleótidos que llevan a cabo diferentes funciones, entre los que se encuentran:
El ATP (adenosín trifosfato), formado por un azúcar ribosa, una base nitrogena- da que es la adenina y tres grupos fosfato. Esta molécula es la principal fuente de energía química en la célula.
El NAD (nicotín adenín dinucleótido), formado por dos nucleótidos. Su fun- ción principal es la recepción y donación de hidrógenos durante las reacciones químicas de transferencia de energía.
El ADP (adenosín difosfato), formado por un azúcar ribosa, una base nitrogenada que es la adenina y dos grupos fosfato. Esta molécula es importante precursor del ATP, la principal fuente de energía química en la célula.
El NADP (nicotín adenín dinucleótido fosfato), que es como el NAD y tiene un grupo fosfato. Esta molécula permite la reducción del dióxido de carbono a fosfogliceraldehído.
El FAD (flavín adenín dinucleótido), también formado por dos nucleótidos. Intercambia hidrógenos, actúa como aceptor/donador de hidrogeniones.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Las endonucleasas de restricción (ER) son enzimas que cortan al DNA de doble hélice en una secuencia específica de pares de bases.
La desnaturalización y la hibridación
La desnaturalización rompe los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las bases y por lo tanto, el DNA de doble hebra.
La temperatura de fusión o Tm (melting temperature) se define como la temperatura en la cual el 50% del DNA está hibridado (es decir, se encuentra en la forma de doble cadena) mientras que el otro 50% está desnaturalizado. Es posible estimar la Tm de porciones cortas de DNA utilizando la siguiente fórmula:
[4 x # pares G+C] + [2 x # pares A+T]
La Tm depende de la composición de bases y la longitud del DNA de doble cadena El calentamiento del DNA a una temperatura de 94°C o mayor desnaturalizará todo el DNA de doble cadena independientemente de su longitud y de su composición de bases. Por ejemplo, la Tm de la siguiente secuencia es:
ATTGCGGAT TAACGCCTA
Tm = (4x4)+ (2x5)= 26°C.
La hibridación del ADN regenera los pares de bases para formar la doble cadena y la
eficiencia de la hibridación depende de:
Los pares de bases A-T sólo forman 2 puentes de hidrógeno.
Las condiciones de baja estringencia.
La composición de bases del ADN
Temperatura de la reacción
El tiempo de hibridación
La concentración de sal de la mezcla de reacción
La concentración del ADN
Identificación de fragmentos de ADN
Las sondas son fragmentos sintéticos de ADN de hebra simple (oligonucleótidos) que tienen una longitud de 12 a 26 nucleótidos, se utilizan para detectar secuencias específicas de ADN gracias a que hibridan porque son complementarias.
Análisis de imágenes
Uno de los sistemas de análisis de imágenes que se utiliza actualmente es el sistema TYPHOON 9410, es un escáner diseñado para realizar la detección y análisis de diferentes imágenes obtenidas de ensayos con marcaje fluorescente principalmente.
De esta forma se pueden visualizar geles y membranas procedentes de ensayos tales como:
geles de proteínas SDS page y 2-D
geles de cuantificación de ácidos nucleicos
Western blooting quimiofluorescente
microarreglos
Southern/Northern fluorescente
diferential display
Electroforesis
La electroforesis a través de un gel de agarosa o poliacrilamida es el método estándar para
purificar fragmentos de ADN
identificar
separar
Esta molécula tiene carga negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato y en un campo eléctrico se aleja del polo negativo (cátodo) y se dirige hacia el polo positivo (ánodo).
Síntesis de ADN
La síntesis del ADN se lleva a cabo mediante una clase de enzimas llamadas ADN polimerasas, las cuales son capaces de sintetizar ADN de cadena sencilla, para que una ADN polimerasa pueda iniciar su proceso, requiere de:
Un iniciador o primer de ADN de cadena sencilla. Es un oligonucleótido sintético que se hibrida o se une al molde. Las polimerasas por lo general agregan nucleótidos en el 3' al final del iniciador y extienden la nueva banda sintetizada del extremo 5' al 3'.
Nucleótidos (dNTP’s) para formar la nueva hebra de ADN.
Un molde o patrón de ADN de hebra simple. Las polimerasas sintetizan un producto cuya secuencia es complementaria a dicho molde. La ADN polimerasa termoestable (ADN Taq polimerasa), el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, las polimerasas T4 y T7 (incluyendo la secuenasa) requieren un molde de ADN. Cuando se usa un molde de RNA, la enzima transcriptasa reversa copia el ARNm para crear ADN complementario (ADNc).
Extracción de ARN
Método modificado de Chomczynsky y Sacchin (1987). Este método se basa en adicionar un reactivo caotrópico (isotiocianato de guanidinio) combinado con la extracción de fenol:cloroformo y una precipitación en alcohol isopropílico.
Enzimas importantes en los ácidos nucleicos
Las enzimas llamadas ADN ligasas (por ejemplo, T4 ADN ligasa) catalizan la formación de enlaces fosfatos en el ADN de doble cadena y se pueden utilizar para unir fragmentos de ADN.
Por ejemplo, los fragmentos de ADN que se han cortado con la enzima de restricción EcoRI se pueden pegar nuevamente al incubar los fragmentos con una ligasa.
Extracción del ADN de las células
Se puede utilizar cualquier célula nucleada como fuente de ADN.
La extracción del ADN implica:
Precipitación del ADN con alcohol isopropílico o etanol absoluto.
Destrucción de la proteinasa K con calor.
Remoción de las proteínas unidas al ADN con proteinasa K o con pronasa.
Lisis de los núcleos usando Tween 20, u otro detergente como el duodecil sulfato de sodio.
Centrifugación para obtener un botón y / lavado de los núcleos
Lisis de la membrana celular utilizando Tritón 100X u otro detergente.
Extracción de ADN en papel FTA
Esta técnica es útil para la toma de muestras en condiciones de campo, dado que permite transportar la muestra sin necesidad de refrigeración, además que el ADN se conserva estable por varios años (siempre y cuando se almacene libre de humedad).
DETECCION DE MUTACIONES EN LOS GENESKRAS Y p53 ASOCIADOS CON LA
SUSCEPTIBILIDAD AL DESARROLLO DE CÁNCER
Ciclo celular
Las células que conforman el tejido normal responden a estímulos y señales tanto externas como internas que les indican si deben proliferar o detener su división.
Cuando este control se pierde, se establece el cáncer debido a la expresión errónea de genes que codifican proteínas reguladoras de este proceso, ya sea por alteraciones genéticas o epigenéticas.
El ciclo celular es un proceso fundamental en todos los organismos, eucariontes y procariontes.
El ciclo celular lo forman las fases G1, S, G2 y M y está acoplado al ciclo de control del crecimiento en el que existen señales de diferenciación celular y factores de crecimiento.
la fase G0 por factores de crecimiento pasa a la fase G1, S, G2 y M para tener una división completa. Una vez que el estímulo del factor de crecimiento desaparece o por medio de factores de diferenciación, la célula regresa a la fase G0.
El receptor se une a su ligando y la parte intracitoplásmica del receptor se acopla a proteínas con actividad de cinasa de tirosina.
El receptor se une a su ligando y la parte citoplásmica activa proteínas con actividad de GTPasa (proteína G).
El receptor se une a su ligando y la parte citoplásmica del receptor tiene actividad enzimática de cinasa de tirosina o de cinasa de serina-treonina.
Genes responsables del cáncer
oncogenes
genes supresores de tumores u oncosupresores
Genes supresores de tumor y oncogenes.
En general, la mitosis se puede regular de dos formas:
Por genes que promueven la división celular (Klug, 1999)
Por genes que detienen la división celular y
Tipos de genes supresores
Los receptores de estos factores inhibidores o de hormonas que frenan el crecimiento celular. La forma mutada del gen oncosupresor codifica un receptor insensible a su ligando o que no transmite la señal al interior de la célula.
Las proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de señales acoplados a los receptores anteriores. La situación varia según sea la función concreta de la proteína.
Las proteínas que frenan el ciclo celular o producen apoptosis. El gen mutado no expresa la proteína o da lugar a una forma no funcional.
Los factores de transcripción que dirigen la expresión de genes cuyos productos proteicos frenan el ciclo celular o producen apoptosis. Ejemplos: los genes oncosupresores Rb y p53.
Los factores inhibidores del crecimiento celular. La mutación del gen oncosupresor correspondiente anula la funcionalidad de la proteína sintetizada. Ejemplo: el gen oncosupresor dcc codifica una proteína de adhesión celular, ausente en el carcinoma de colon.
Características de la expresión de los genes oncosupresores
La pérdida de la función de un gen oncosupresor sólo se produce cuando han mutado los dos alelos (individuos homocigóticos).
La herencia de los genes oncosupresores mutados corresponde a su carácter recesivo, pero sólo tiene lugar cuando la mutación ha afectado a células germinales.
Tipos de protooncogenes
Las proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de señales. La mutación hace que el oncogén exprese una proteína que se mantiene activa sin necesidad de que le llegue la señal.
Los factores de transcripción que controlan la expresión de los genes que codifican a su vez proteínas implicadas en la señalización, el control del ciclo celular o la apoptosis.
Los receptores de factores de crecimiento o de hormonas, presentes en la membrana o dentro de la célula. Para el caso de un factor de crecimiento u hormona estimuladora de la proliferación, la forma oncoproteíca del receptor puede ser
aquella con una conformación que la mantiene activa, aunque no
se le una al ligando. Si se trata del receptor de un factor u hormona inhibidores del crecimiento, la oncoproteína es aquella que no responde a la unión del ligando.
Las proteínas responsables de la activación directa del ciclo celular (tales como las ciclinas o las cinasas y fosfatasas activadoras de las Cdk) o de la inhibición de la apoptosis. Los oncogenes respectivos expresan proteínas en mayor cantidad o con la función aumentada.
Los factores estimuladores del crecimiento celular. La mutación oncogénica origina una producción excesiva del factor proteico o una mayor actividad de éste.
Características de la expresión de los oncogenes
Puesto que existe ganancia de función en la oncoproteína, basta con que este mutado uno de los dos alelos del protooncogen para que se exprese el efecto de la oncoproteína anormal.
En consecuencia, los oncogenes se expresan con carácter dominante, y los individuos heterocigotos para un oncogen sufren sus efectos de forma similar a los homocigóticos (Klug, 1999; Luque y Herráez, 2001; Panduro, 2000).
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICAS PARA EL ESTUDIO DE GENES REALCIONADOS CON CÁNCER
Extracción de ADN:
Primera etapa: lisis celular por acción de algunos detergentes.
Segunda etapa: extracción orgánica (desnaturalización de las proteínas).
Tercera etapa: precipitación con alcohol absoluto.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Primero, el ADN que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas.
Los cebadores hibridan al ADN de cadena sencilla.
A la mezcla de reacción se le añade una ADN polimerasa resistente al calor (polimerasa Taq).
Electroforesis
Gel de acrilamida
cámara de electroforesis conectada a una fuente de poder
Fotografía de un gel de acrilamida una vez teñido con bromuro de etidio.
Secuenciación (Método enzimático o de didesóxidos)
No resultó sencillo conocer la secuencia del genoma humano, en la actualidad se conocen las secuencias de una considerable cantidad de genes y varias alteraciones estructurales como:
inserciones
deleciones
mutaciones
Para llevar a cabo el método de didesóxidos, se requiere:
molde de ADN
un iniciador (cebador)
desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
didesoxirribonucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
y la enzima polimerasa de DNA (Taq Polimerasa de DNA) en un amortiguador que contenga cloruros de Magnesio y de Potasio (MgCl2, KCl) (Micklos, 2003).
Para que la polimerasa de DNA pueda iniciar su síntesis, es necesario que los cebadores se fijen de forma específica al molde de DNA, así, la enzima comienza a añadir dNTP a la cadena en crecimiento por complementariedad de bases (se forma un enlace fosfodiestér entre el extremo 3′OH terminal de la cadena y el grupo 5′PO42-del dNTP añadido).
IDENTIFICACIÓN HUMANA CON FINES DE EXCLUSIÓN DE PATERNIDAD
Las características del ADN que lo hacen una
herramienta sumamente eficaz son:
Presenta alta variabilidad y diversidad de características entre individuos (a excepción de los gemelos idénticos).
Perennidad, dado que se encuentra presente desde antes de nacer hasta después de morir.
Es inmutable, ya que este material genético en un mismo individuo prácticamente no cambia a menos que se exponga a radiaciones o a agentes químicos extraordinariamente tóxicos.
Se conoce el modo de herencia, por lo que se pueden realizar estudios de paternidad, pruebas de parentesco reverso, linaje paterno y materno.
Criterios convencionales de identificación humana
Peso, talla y edad estimadas
Sistema piloso: (color, forma y tipo de implantación, ausencia)
Sexo: puede presentar complicaciones en casos de hermafroditismo
Color de ojos y piel
Descripción de los rasgos fisonómicos
Marcas particulares: (cicatrices, defectos congénitos, tatuajes)
Registro de la voz (frecuencia y amplitud de las vibraciones de las cuerdas vocales)
Trazado caligráfico (haciendo comparación con escritos indubitados)
TECNICAS BIOQUIMICAS EMPLEADAS EN LA IDENTIFICACION HUMANA: Estas técnicas se fundamentan en la comparación de diversos productos de expresión génica como: estos se transmiten siguiendo la herencia mendeliana.
Enzimas eritrocitarias
Proteínas plasmáticas
Grupos sanguíneos
Antígenos de histocompatibilidad (HLA):
Biología del ADN
Técnicas moleculares utilizadas en la identificación humana
En 1985, por vez primera se resolvió un caso judicial gracias a la aplicación de técnicas donde se caracterizaron secuencias hipervariables en el ADN.
Los resultados obtenidos mediante el estudio de las huellas digitales genéticas (DNA- Fingerprinting) permitieron la aclaración de una disputa por inmigración en la Gran Bretaña.
Valoración de la fuerza de la evidencia
El propósito de la tipificación de ADN es probar la hipótesis de que una persona en particular es la fuente del material biológico que se encontró en el lugar de los hechos.
Las tres conclusiones posibles que se derivan son:
Con base en los resultados no es posible estar seguros de la prueba, si las muestras tienen el mismo tipo de ADN (inconcluso). Esto puede ocurrir por: la degradación, la contaminación, o falla en algunos aspectos del procedimiento.
Los perfiles son iguales y pudieron originarse de la misma fuente.
Los perfiles son diferentes y entonces se debieron originar de diferentes fuentes(exclusión).
Determinación de la concordancia genética
En los sistemas basados en PCR que se desarrollaron para uso forense, los marcadores de secuencia o longitud se detectan fácilmente como alelos discretos.
Evaluación de los resultados:
La concordancia es una coincidencia: la evidencia proviene de otra persona que donó la muestra de referencia. La concordancia resulta de dos individuos, el donador de la referencia y el donador verdadero que por coincidencia comparte el mismo perfil genético en los marcadores genéticos analizados.
Las muestras provienen de una fuente común, esto significa que la evidencia viene de la misma persona que donó la muestra de referencia.
La concordancia es un accidente (error): la evidencia proviene de otra persona diferente del donador de la muestra de referencia, pero ocurrió un error en la recolección, en el procedimiento analítico o burocrático de forma que la evidencia y la muestra de referencia parecen tener el mismo perfil genético.
Pruebas de paternidad
El fundamento de la paternidad es de que, en ausencia de mutación, un niño recibe un alelo de cada progenitor en cada locus genético estudiado.
La determinación de paternidad se basa en el hecho de si existen alelos compartidos entre el probable padre y el menor cuando se estudia una gran cantidad de marcadores genéticos.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La PCR es una técnica enzimática de amplificación in vitro del ADN, extraordinariamente versátil por su sensibilidad, especificidad y sencillez.
La reacción consta de tres pasos, repetidos cíclicamente:
Desnaturalización, a temperaturas del orden de 95 °C, que separa las dos hebras del ADN diana.
Hibridación de los cebadores, reduciendo la tempera- tura hasta que se formen híbridos estables de cada cebador con su diana
Elongación, a temperatura compatible con la acción de la polimerasa, que cataliza la formación de una monohebra complementaria de la diana, en sentido 5’→3’, a partir del cebador.
Los tres pasos descritos constituyen un ciclo. Una PCR típica suele constar de unos 30 ciclos consecutivos
ESTUDIANTE: DANNY VIVIAN VARGAS CODNORI
GRUPO:5
