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BIOLOGOA MOLECULAR
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Extração e Purificação de Ácidos Nucleicos
Métodos de Cultivo?
... estima-se que menos de 1% dos micro-organismos em amostras naturais são cultiváveis! (PACE et al 1986).
Isolamento e Purificação de Ácidos Nucleicos
DNA celular total (DNA genômico):
Fontes de material a partir do qual os genes serão estudados.
Culturas bacterianas; vegetais; animais ou qualquer outro tipo de organismo em estudo.
DNA plasmidial:
Isolamento a partir de cultura bacteriana.
Etapa de separação do DNA genômico.
RNA:
Análise de expressão gênica.
Cultura bacterianas; vegetais; animais ou qualquer outro tipo de organismo em estudo.
DNA de fago
Técnicas especiais para remoção do capsídeo.
Preparo a partir de partículas virais.
Utilização como veículos de clonagem.
Isolamento e purificação de outros materiais componentes de amostras biológicas e do meio de cultivo
Problemas:
Lipídeos.
Metais.
Proteínas.
Sais.
Ácidos ou bases ...
Objetivos:
Remover inibidores (metais, polissacarídeos).
Remover ou inibir nucleases.
Maximizar a recuperação de DNA ou RNA .
Maximizar a qualidade da preparação.
Remover substâncias fenólicas ou outros compostos secundários que podem danificar os ácidos nucleicos extraídos.
Requisitos essenciais para obtenção dos ácidos nucleicos :star:
Integridade.
As moléculas de ácidos nucléicos estão integras ou houve degradação?.
Pureza.
Os ácidos nucléicos foram obtidos com alto grau de pureza ou existem contaminantes na amostra?
Quantidade(Rendimento).
Que quantidade / concentração foi obtida de ácidos nucléicos na extração?
Fontes.
Fósseis.
Tecidos frescos.
Cultura de calos.
Sangue e outros fluídos.
Amostra de água.
Culturas de células em em meio sólido.
Solo.
Culturas de células em suspensão.
Etapas de isolamento e purificação de Ácidos Nucleicos.
Purificação do DNA ou RNA a
partir do extrato celular.
Concentração dos ácidos
nucleicos extraídos.
Lise das membranas
celulares.
ROMPIMENTO CELULAR.
LISE CELULAR
Rompimento de barreiras: Parede Celular; Membrana
Celular e Membrana Externa.
MÉTODOS FÍSICOS.
Rompimento por forças mecânica ou
pela temperatura.
Temperatura depende do tipo celular.
Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria Gramnegativa), ocorre com aquecimento a 90ºC por 15 minutos.
Uma suspensão de Bacilus megaterium, nas mesmas condições, proporciona
o rompimento de menos da metade das células (bactéria Gram-positivacamada mais espessa de peptideoglicano).
Temperatura elevada.
Gera fragmentos celulares de maiores dimensões (mais fácil
separação por centrifugação).
Aquecimento da suspensão celular em banho termostatizado.
Tipos:
Sonicação
O fenômeno da cavitação, produz um choque
de ondas muito intenso, gerando um forte estresse local, deformando o limite das células
e levando ao seu rompimento.
Rompe as membranas através de
som de alta frequência.
O rompimento ocorre quando ondas sonoras
(~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação.
Ciclos de congelamento/descongelamento.
As células passam por repetidos ciclos de congelamento e
descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la facilitando a ação de
outros agentes.
Maceração após o congelamento
do tecido em nitrogênio líquido.
Homogeneização de alta pressão.
Moinho de bolas
Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou
horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro.
O rompimento ocorre
devido à força de cisalhamento
aplicada pelas esferas de vidro contra a
parede celular.
MÉTODOS
QUÍMICOS.
Agentes que afetam
a integridade das barreiras celulares.
Agente que ataca a parede celular e um outro que rompe a membrana
da célula.
dependem do tipo de célula.
Lise química
Mais usada quando as células bacterianas devem ser
lisadas visando à preparação de ácidos nucleicos.
Tipos:
Lisozima
+
EDTA
3 more items...
Capaz de digerir os compostos poliméricos que
conferem rigidez à parede celular.
Degradação da parede lipoproteica de bactérias (não afeta
células vegetais).
Proteinase K
degradação de proteínas (mais ativa em proteínas
desnaturadas).
DETERGENTES.
CTAB, Sarcosil, Lauril sulfato de sódio, Triton e SDS são utilizados para auxiliar
na liberação de componentes celulares por lise das membranas celulares.
São capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes celulares.
Juntamente com NaCl, esses detergentes ajudam na precipitação do DNA ao
final do processo e reduzem a contaminação da amostra com polissacarídeos.
Rompimento Celular.
MÉTODOS QUÍMICOS
CTAB
Brometo de cetil-trimetil-amônio
detergente – complexa
com os ácidos nucleicos e precipita.
O NaCl desfaz os complexos entre o CTAB e o DNA.
TIOCIANATO DE GUANIDINA.
Desnatura e dissolve todos os
compostos bioquímicos que não são ácidos nucleicos (liberar DNA de qualquer tipo de tecido).
Na presença deste reagente, o
DNA liga-se fortemente à partículas de sílica
Permitindo a sua separação dos
demais compostos desnaturados.
Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos:
Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas.
Agentes que retardam atividade das nucleases:
Tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético)
Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração).
Inibir RNAses (proteinase K; DEPC – dietilpirocarbonato ).
Inibir DNAses
Manter o pH em um valor que impeça a ação destas
enzimas, utiliza-se um tampão específico (geralmente Tris-HCl), para manter o pH em torno de 8,0.
Extração em baixas temperaturas.
Purificação de Ácidos Nucleicos.
Para o isolamento e purificação de ácidos nucléicos, é necessário
separá-los efetivamente dos outros constituintes celulares.
É fundamental manter a integridade das moléculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extração, pois as informações contidas tanto no DNA quanto no RNA dependem
da sua sequência.
Existem vários métodos descritos na literatura, e a escolha
depende do balanço entre a praticidade, qualidade requerida, questões econômicas e a finalidade de uso do ácido nucléico.
Extração com SOLVENTES ORGÂNICOS.
Extração com FENOL.
Fenol é usado para desnaturar e remover proteínas de soluções que contêm ácidos nucléicos.
Precipita as proteínas e os ácidos nucleicos
permanecem em solução aquosa.
