Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Amplifikasi DNA dengan PCR, bingung, image - Coggle Diagram
Amplifikasi DNA dengan PCR
Definisi
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan proses sintesis enzimatis untuk melipatgandakan (mengamplifikasi) nukleotida (DNA/RNA) secara eksponensial dengan teknit in vitro
Jenis-jenis PCR
Conventional PCR
Multiplex PCR
, bisa menggunakan lebih dari satu primer
Allele-Spesific PCR
, dapat digunakan apabila memiliki sampel yang spesifik
Alu PCR,
dapat digunakan apabila kita tidak memiliki sampel yang spesifik
Reverse transcriptase PCR
, sampel yang digunakan RNA
Nanoparticiple-assited PCR
, bisa mengabsropsi enzim polimerase sehingga enzimnya dapat bertahan lama
Reverse transcriptase real time PCR
, dapat digunakan untuk konfirmasi terinfeksi oleh SARS-CoV-2 dengan akurat
Netsed PCR
, untuk sampel yang sedikit dan tidak spesifik
Kekurangan
Proses penggandaan memerlukan urutan (sequence) DNA untuk mendesain primer, kecuali aluPCR
Kemurnian DNA berpengaruh terhadap hasil PCR
Perlu skill khusus untuk operator
Kelebihan
Otomatis, akurat, dan spesifik.
Thermocycler secara tepat meregulasi suhu dan siklus waktu, mengamplifikasi secara spesifik karena adanya primer unik
Total volume rendah
Sensitif
, dengan jumlah sampel yang sangat sedikit kita tetap dapat mengidentifikasi sampel
Relatif cepat
, copy fragmen DNA 20.000 kali, 20 siklus selama 22 menit
Komponen PCR
dNTP (deoxynucleotidetriphosphate)
, dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan
MgCl2
, MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses
DNA Template
, sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama
Primer dan Taq Polimerase
, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi, Taq polimerase merupakan enzim DNA polimerase stabil suhu pertama yang berhasil dipurifikasi dari bakteri termofil ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik
Nuclease Free Water
, air khusus karena sudah bebas dari enzim nuklease supaya dna yang kita perbanyak tetap menjadi stabil tidak terganggu dengan enzim nuklease
Buffer PCR
, Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium
Manfaat
Genetic Research
Diagnosa penyakit
Forensic Science
Food and Agriculture
Environmental Microbiology
Siklus PCR
Denaturasi (pemisahan DNA)
, Suhu 92-95⁰C Waktu 1-2 mnt
rantai dna ganda dipisahkan. Cara melakukan denaturasi kalau ditahap alami menggunakan enzim helikase, tetapi pada PCR ini hanya menggunakan pengaturan suhu
Anneling (Penempelan primer pada DNA template
, Suhu 55⁰C Waktu 1- 2 mnt
Annealing penempelan primer. Penempelan primer dapat dilakukan dengan penurunan suhu menjadi 55⁰C, biasanya suhu annealing ini berdasarkan urutan primer bisa dilihat dari temperature melting
Polimerisasi (Pemanjangan Rantai DNA)
,Suhu 70-72⁰C Waktu 30detik-2 mnt
. Polimerisasi, perpanjangan rantai. setelah diperpanjang akan terbentuk 2 rantai dna yang terbaru
Tahap Pembuatan
https://www.youtube.com/watch?v=fTbQ8xG-5SI
https://www.youtube.com/watch?v=C11iFGAJQ8s
