ACIDOS NUCLEICOS Y PRUEBAS GENETICAS

Electroforesis

Analisis de imagenes

Estructura

Fundamento teórico

Apartir de 1953 James y Francis reportaron el descubrimiento de la estructura molecular del ADN, es una herramienta fundamental en biomedicina

El manejo de genes humanos ha permitido el estudio de la constitucion genetica del hombre, tambien utilizo los genes como marcadores lo que ha facilitado el diagnostico prenatal o la deteccion de portadores sanos de enfermedades geneticas

La carecterizacion de nuevos oncogenes ha permitido comprender los cambios estables que se presentan en el genoma durante el cancer, y tambien para la deteccion de esta enfermedad

Diagnostico molecular de las enfermedades infecciosas permite conocer las diferencias o similitudes, tambien en la genetica forense el estudio de las regiones polimorficas en el ADN

LOs acidos ribunucleico y desoxirribonucleico son las biomoleculas responsables de resguardar la informacion genetica del organismo

En el ARN de ribonucletidos tienen el azucar ribosa, mientras que los desoxirribunucleotidos contienen el azucar desorribosa

LAs bases nitrogenadas son las purinas adenina y guanina y las pirimidinas timina citosina y uracilo

Al formar las cadenas cada nucleotido se une a otro a traves de un enlace fosfodiester constituido entre el OH del carbono 3 del azucar y el fosfato

El ADN contiene la informacion genetica con la que se elaboraran las proteinas del organismo el acido desoxirribonucleico esta formado por dos cadenas de desoxirribonucleotidos el cual esta por cadenas nitrogenadas

Identificacion de fragmentos de ADN

Endonucleasasde restriccion

Son enzimas que cortan al DNA de dble helice en una secuencia especifica de pares de bases las cuales son palindromas

Depende de la enzima de restriccion los extremos que se generan despues del corte son planos o tienen una protuberancia en el extremo 5 o 3

5´GAATTCGACTGCCATA 3´ Y LA 3´CTTTAAGTGACGGTAT 5´

La desnaturalizacion y la hibridacion

Rompe los enlaces de hidrogeno que manyienen unidas las bases y por lo tanto el ADN de doble hebra

La temperatura de fusion o Tm se define como la temperatura en el 50% del ADN esta hibridado y el otro 50% es desnaturalizado

ATTGCGGAT TAACGCCTA Tm=(4x4)+(2x5)=26°c

Los pares de bases A-T solo forman puentes de hidrogeno

Las condiciones de baja estringencia

Temperatura de la reacción

LA concentración de sal de la mezcla de reacción

La composición de bases del ADN

El tiempo de hibridacion

La concentracion del ADN

Si desnaturalizamos el ADN aislado a partir de una celula humana le tomara un largo tiempo a una de las hebaras de un gen para la insulina

Entre mas compleja sea la mezcla de ADN mas tiempo le tomara a una hebra simple de ADN al encontrar su hebra complementaria

Las proporciones de pares G-C tienden a unirse mas rapidamente que las porciones de pares A-t para formar un ADN de doble cadena

El cloruro de
tetrametilamonio o TMAC es un compuesto químico que causa que el ADN se una
a una velocidad que depende únicamente de su longitud y no del número de pares
G-C.

Cuando la estringencia es baja, las hebras
simples de ADN se ligan unas a otras de forma imperfecta. Por el contrario, bajo
condiciones de alta estringencia, sólo se unen las secuencias que son perfectamente
compatibles

Las temperaturas altas hacen que las hebras de DNA
se muevan más rápidamente. Los híbridos de DNA que se unen con imperfecciones
se disocian más rápidamente a altas temperaturas y por lo tanto, favorecen

: Las concentraciones altas de
sal permiten que se formen híbridos imperfectamente compatibles mientras que a
bajas concentraciones de sal se formarán sólo híbridos perfectamente compatibles

Las sondas son fragmentos sintéticos de ADN de hebra simple (oligonucleótidos) que tienen
una longitud de 12 a 26 nucleótidos

Generalmente una hebra de ADN
se une a un soporte sólido, por ejemplo, una membrana, para incrementar la velocidad, lo
que ayuda a detectar la reacción de hibridación.

Detección de la hibridación. Si la sonda está marcada la hibridación puede detectarse con
la marca. Las sondas se pueden marcar con fósforo radioactivo (P32)

Uno de los sistemas de análisis de imágenes que se utiliza actualmente es el sistema
TYPHOON 9410, es un escáner diseñado para realizar la detección y análisis de diferentes
imágenes obtenidas de ensayos con marcaje fluorescente principalmente.

a través de un gel de agarosa o poliacrilamida es el método estándar para
separar, identificar, y purificar fragmentos de ADN (Hamdan et al., 1998; Job, 1928). Esta
molécula tiene carga negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato y en un campo
eléctrico se aleja del polo negativo

El gel es una matriz a través de la cual migran los fragmentos de ADN. Los geles de
policrilamida se usan para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños y se utilizaban
anteriormente para la secuenciación de ADN o para la purificación de oligonucleótidos. Los
geles de agarosa, por su parte, se usan para separar fragmentos de ADN de mayor tamaño

Sintesis de ADN

La síntesis del ADN se lleva a cabo mediante una clase de enzimas llamadas ADN
polimerasas, las cuales son capaces de sintetizar ADN de cadena sencilla, para que una
ADN polimerasa pueda iniciar su proceso, requiere de

Un molde o patrón de ADN de hebra simple. Las polimerasas sintetizan un producto
cuya secuencia es complementaria a dicho molde.

Un iniciador o primer de ADN de cadena sencilla. Es un oligonucleótido sintético que
se hibrida o se une al molde

Nucleótidos (dNTP’s) para formar la nueva hebra de ADN.

Enzimas importantes en los acidos nucleicos

Las enzimas llamadas ADN ligasas (por ejemplo, T4 ADN ligasa) catalizan la formación de
enlaces fosfatos en el ADN de doble cadena y se pueden utilizar para unir fragmentos de
ADN

Las cinasas como la T4 polinucleótido cinasa agregan fosfatos en los extremos 5' de los
fragmentos de ADN,

La transferasa terminal agrega nucleótidos en los extremos 3' de las moléculas de ADN y
hace una cola de una sola hebra.

Extracción del ADN de las células

Se puede utilizar cualquier célula nucleada como fuente de ADN. Aunque los eritrocitos no
tienen núcleo, otras células sanguíneas, como los leucocitos

Lisis de la membrana celular utilizando Tritón 100X u otro detergente.
• Centrifugación para obtener un botón y / lavado de los núcleos
• Lisis de los núcleos usando Tween 20, u otro detergente como el duodecil sulfato de
sodio.

Extracción de ADN en papel FTA

Esta técnica es útil para la toma de muestras en condiciones de campo, dado que permite
transportar la muestra sin necesidad de refrigeración

además que el ADN se conserva
estable por varios años (siempre y cuando se almacene libre de humedad).

DIAGRAMA DE FLUJO

Extraccion de la muestra

Lisis de eritrocitos

Eliminacion de hemoglobina

Lisis de nucleos

Agecion de agentes caotropicos

extraccion organica

separacion de la fase aguda

precipitacion con etanol y cloroformo

DETECCION DE MUTACIONES EN LOS GENES KRAS Y p53 ASOCIADOS CON LA SUSCEPTIBILIDAD AL DESARROLLO DE CANCER

La ocurrencia de tumores malignos constituye uno de los principales problemas de salud en
el mundo

Genes supresores de tumor y oncogenes

Genes responsable del cancer

Ciclo celular

Tipo de genes supresores

Caracteristicas de la expresion de los genes oncosupresores

Las células que conforman el tejido normal responden a estímulos y señales tanto externas
como internas que les indican si deben proliferar o detener su división

El ciclo celular es un proceso fundamental en todos los organismos, eucariontes y
procariontes. Es la rutina metabólica que realiza una célula para multiplicarse por medio de
una red de eventos bioquímicos y moleculares

El ciclo celular lo forman las fases G1, S, G2 y M y está acoplado al ciclo de control del
crecimiento en el que existen señales de diferenciación celular y factores de crecimiento.

Las mutaciones, presentes en las células cancerosas, que provocan la aparición de las
características tumorales afectan genes cuyos productos proteicos

En general, la mitosis se puede regular de dos formas:

  1. Por genes que detienen la división celular y
  2. Por genes que promueven la división celular

Los genes oncosupresores codifican proteínas que actúan en distintos puntos de las rutas
de señalización

Los factores inhibidores del crecimiento celular

Los receptores de estos factores inhibidores o de hormonas

Las proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción

Los factores de transcripción que dirigen la expresión de genes

Las proteínas que frenan el ciclo celular

La pérdida de la función de un gen oncosupresor sólo se produce cuando han mutado los dos alelos

Es decir, la forma mutada de un gen oncosupresor
se expresa con carácter recesivo

tipos de protooncogenes

Los factores estimuladores del crecimiento celular.

Los receptores de factores de crecimiento o de hormonas,

Las proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción

Los factores de transcripción que controlan la expresión de los genes

Los factores de transcripción que controlan la expresión de los genes

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR BASICAS PARA EL ESTUDIO DE GENES RELACIONADOS CON CANCER

Reaccion en cadena de la polimerasa PCR

Extarccion de ADN

La estructura básica del ADN es idéntica en todos los organismos; está compuesto por
cadenas de nucleótidos unidas

El ADN está localizado dentro del núcleo de las células eucarióticas, rodeado de
proteínas, histonas y organizado en cromosomas

El aislamiento del ADN, es el primer paso en cualquier análisis genético. Dada la
complejidad de esta molécula, los ácidos nucleicos

Se basa en la amplificación de un segmento de ADN utilizando ADN polimerasa y
cebadores, oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria de la secuencia a
amplificar

tres pasos fundamentales en la reacción de PCR

  1. Primero, el ADN que se quiere amplifica 2. Los cebadores hibridan al ADN de cadena sencilla. 3. A la mezcla de reacción se le añade una ADN polimerasa resistente al calor

Electrofosferasa

Se basa en la capacidad de las macromoléculas cargadas para desplazarse en un campo
eléctrico, con velocidad proporcional a su carga

sólo este determinada por el
tamaño de la molécula. La separación de los fragmentos de ADN d

ADN que se requiere separar.
Una vez separadas las moléculas de ADN se visualizan normalmente

UNIVERSITARIO BORIS GERMAN CORONEL LAURA GRUPO 1