ACIDOS NUCLEICOS Y PRUEBAS GENETICAS
Electroforesis
Analisis de imagenes
Estructura
Fundamento teórico
Apartir de 1953 James y Francis reportaron el descubrimiento de la estructura molecular del ADN, es una herramienta fundamental en biomedicina
El manejo de genes humanos ha permitido el estudio de la constitucion genetica del hombre, tambien utilizo los genes como marcadores lo que ha facilitado el diagnostico prenatal o la deteccion de portadores sanos de enfermedades geneticas
La carecterizacion de nuevos oncogenes ha permitido comprender los cambios estables que se presentan en el genoma durante el cancer, y tambien para la deteccion de esta enfermedad
Diagnostico molecular de las enfermedades infecciosas permite conocer las diferencias o similitudes, tambien en la genetica forense el estudio de las regiones polimorficas en el ADN
LOs acidos ribunucleico y desoxirribonucleico son las biomoleculas responsables de resguardar la informacion genetica del organismo
En el ARN de ribonucletidos tienen el azucar ribosa, mientras que los desoxirribunucleotidos contienen el azucar desorribosa
LAs bases nitrogenadas son las purinas adenina y guanina y las pirimidinas timina citosina y uracilo
Al formar las cadenas cada nucleotido se une a otro a traves de un enlace fosfodiester constituido entre el OH del carbono 3 del azucar y el fosfato
El ADN contiene la informacion genetica con la que se elaboraran las proteinas del organismo el acido desoxirribonucleico esta formado por dos cadenas de desoxirribonucleotidos el cual esta por cadenas nitrogenadas
Identificacion de fragmentos de ADN
Endonucleasasde restriccion
Son enzimas que cortan al DNA de dble helice en una secuencia especifica de pares de bases las cuales son palindromas
Depende de la enzima de restriccion los extremos que se generan despues del corte son planos o tienen una protuberancia en el extremo 5 o 3
5´GAATTCGACTGCCATA 3´ Y LA 3´CTTTAAGTGACGGTAT 5´
La desnaturalizacion y la hibridacion
Rompe los enlaces de hidrogeno que manyienen unidas las bases y por lo tanto el ADN de doble hebra
La temperatura de fusion o Tm se define como la temperatura en el 50% del ADN esta hibridado y el otro 50% es desnaturalizado
ATTGCGGAT TAACGCCTA Tm=(4x4)+(2x5)=26°c
Los pares de bases A-T solo forman puentes de hidrogeno
Las condiciones de baja estringencia
Temperatura de la reacción
LA concentración de sal de la mezcla de reacción
La composición de bases del ADN
El tiempo de hibridacion
La concentracion del ADN
Si desnaturalizamos el ADN aislado a partir de una celula humana le tomara un largo tiempo a una de las hebaras de un gen para la insulina
Entre mas compleja sea la mezcla de ADN mas tiempo le tomara a una hebra simple de ADN al encontrar su hebra complementaria
Las proporciones de pares G-C tienden a unirse mas rapidamente que las porciones de pares A-t para formar un ADN de doble cadena
El cloruro de
tetrametilamonio o TMAC es un compuesto químico que causa que el ADN se una
a una velocidad que depende únicamente de su longitud y no del número de pares
G-C.
Cuando la estringencia es baja, las hebras
simples de ADN se ligan unas a otras de forma imperfecta. Por el contrario, bajo
condiciones de alta estringencia, sólo se unen las secuencias que son perfectamente
compatibles
Las temperaturas altas hacen que las hebras de DNA
se muevan más rápidamente. Los híbridos de DNA que se unen con imperfecciones
se disocian más rápidamente a altas temperaturas y por lo tanto, favorecen
: Las concentraciones altas de
sal permiten que se formen híbridos imperfectamente compatibles mientras que a
bajas concentraciones de sal se formarán sólo híbridos perfectamente compatibles
Las sondas son fragmentos sintéticos de ADN de hebra simple (oligonucleótidos) que tienen
una longitud de 12 a 26 nucleótidos
Generalmente una hebra de ADN
se une a un soporte sólido, por ejemplo, una membrana, para incrementar la velocidad, lo
que ayuda a detectar la reacción de hibridación.
Detección de la hibridación. Si la sonda está marcada la hibridación puede detectarse con
la marca. Las sondas se pueden marcar con fósforo radioactivo (P32)
Uno de los sistemas de análisis de imágenes que se utiliza actualmente es el sistema
TYPHOON 9410, es un escáner diseñado para realizar la detección y análisis de diferentes
imágenes obtenidas de ensayos con marcaje fluorescente principalmente.
a través de un gel de agarosa o poliacrilamida es el método estándar para
separar, identificar, y purificar fragmentos de ADN (Hamdan et al., 1998; Job, 1928). Esta
molécula tiene carga negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato y en un campo
eléctrico se aleja del polo negativo
El gel es una matriz a través de la cual migran los fragmentos de ADN. Los geles de
policrilamida se usan para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños y se utilizaban
anteriormente para la secuenciación de ADN o para la purificación de oligonucleótidos. Los
geles de agarosa, por su parte, se usan para separar fragmentos de ADN de mayor tamaño
Sintesis de ADN
La síntesis del ADN se lleva a cabo mediante una clase de enzimas llamadas ADN
polimerasas, las cuales son capaces de sintetizar ADN de cadena sencilla, para que una
ADN polimerasa pueda iniciar su proceso, requiere de
Un molde o patrón de ADN de hebra simple. Las polimerasas sintetizan un producto
cuya secuencia es complementaria a dicho molde.
Un iniciador o primer de ADN de cadena sencilla. Es un oligonucleótido sintético que
se hibrida o se une al molde
Nucleótidos (dNTP’s) para formar la nueva hebra de ADN.
Enzimas importantes en los acidos nucleicos
Las enzimas llamadas ADN ligasas (por ejemplo, T4 ADN ligasa) catalizan la formación de
enlaces fosfatos en el ADN de doble cadena y se pueden utilizar para unir fragmentos de
ADN
Las cinasas como la T4 polinucleótido cinasa agregan fosfatos en los extremos 5' de los
fragmentos de ADN,
La transferasa terminal agrega nucleótidos en los extremos 3' de las moléculas de ADN y
hace una cola de una sola hebra.
Extracción del ADN de las células
Se puede utilizar cualquier célula nucleada como fuente de ADN. Aunque los eritrocitos no
tienen núcleo, otras células sanguíneas, como los leucocitos
Lisis de la membrana celular utilizando Tritón 100X u otro detergente.
• Centrifugación para obtener un botón y / lavado de los núcleos
• Lisis de los núcleos usando Tween 20, u otro detergente como el duodecil sulfato de
sodio.
Extracción de ADN en papel FTA
Esta técnica es útil para la toma de muestras en condiciones de campo, dado que permite
transportar la muestra sin necesidad de refrigeración
además que el ADN se conserva
estable por varios años (siempre y cuando se almacene libre de humedad).
DIAGRAMA DE FLUJO
Extraccion de la muestra
Lisis de eritrocitos
Eliminacion de hemoglobina
Lisis de nucleos
Agecion de agentes caotropicos
extraccion organica
separacion de la fase aguda
precipitacion con etanol y cloroformo
DETECCION DE MUTACIONES EN LOS GENES KRAS Y p53 ASOCIADOS CON LA SUSCEPTIBILIDAD AL DESARROLLO DE CANCER
La ocurrencia de tumores malignos constituye uno de los principales problemas de salud en
el mundo
Genes supresores de tumor y oncogenes
Genes responsable del cancer
Ciclo celular
Tipo de genes supresores
Caracteristicas de la expresion de los genes oncosupresores
Las células que conforman el tejido normal responden a estímulos y señales tanto externas
como internas que les indican si deben proliferar o detener su división
El ciclo celular es un proceso fundamental en todos los organismos, eucariontes y
procariontes. Es la rutina metabólica que realiza una célula para multiplicarse por medio de
una red de eventos bioquímicos y moleculares
El ciclo celular lo forman las fases G1, S, G2 y M y está acoplado al ciclo de control del
crecimiento en el que existen señales de diferenciación celular y factores de crecimiento.
Las mutaciones, presentes en las células cancerosas, que provocan la aparición de las
características tumorales afectan genes cuyos productos proteicos
En general, la mitosis se puede regular de dos formas:
- Por genes que detienen la división celular y
- Por genes que promueven la división celular
Los genes oncosupresores codifican proteínas que actúan en distintos puntos de las rutas
de señalización
Los factores inhibidores del crecimiento celular
Los receptores de estos factores inhibidores o de hormonas
Las proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción
Los factores de transcripción que dirigen la expresión de genes
Las proteínas que frenan el ciclo celular
La pérdida de la función de un gen oncosupresor sólo se produce cuando han mutado los dos alelos
Es decir, la forma mutada de un gen oncosupresor
se expresa con carácter recesivo
tipos de protooncogenes
Los factores estimuladores del crecimiento celular.
Los receptores de factores de crecimiento o de hormonas,
Las proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción
Los factores de transcripción que controlan la expresión de los genes
Los factores de transcripción que controlan la expresión de los genes
TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR BASICAS PARA EL ESTUDIO DE GENES RELACIONADOS CON CANCER
Reaccion en cadena de la polimerasa PCR
Extarccion de ADN
La estructura básica del ADN es idéntica en todos los organismos; está compuesto por
cadenas de nucleótidos unidas
El ADN está localizado dentro del núcleo de las células eucarióticas, rodeado de
proteínas, histonas y organizado en cromosomas
El aislamiento del ADN, es el primer paso en cualquier análisis genético. Dada la
complejidad de esta molécula, los ácidos nucleicos
Se basa en la amplificación de un segmento de ADN utilizando ADN polimerasa y
cebadores, oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria de la secuencia a
amplificar
tres pasos fundamentales en la reacción de PCR
- Primero, el ADN que se quiere amplifica 2. Los cebadores hibridan al ADN de cadena sencilla. 3. A la mezcla de reacción se le añade una ADN polimerasa resistente al calor
Electrofosferasa
Se basa en la capacidad de las macromoléculas cargadas para desplazarse en un campo
eléctrico, con velocidad proporcional a su carga
sólo este determinada por el
tamaño de la molécula. La separación de los fragmentos de ADN d
ADN que se requiere separar.
Una vez separadas las moléculas de ADN se visualizan normalmente
UNIVERSITARIO BORIS GERMAN CORONEL LAURA GRUPO 1