Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
PROTEIN Isolasi Protein, Plant Tissue (leaf 0,5 g. root 1,5 g), Tujuan…
Isolasi Protein
Definisi
Isolasi protein adalah produk turunan yang memiliki kandungan protein hingga 90% dalam berat kering.Tahapan di isolasi protein memiliki 2 tahap yaitu penghancuran sel dan pemisahan partikel dari suspensi melalui sentrifugasi
Gugus Protein
Hidrofobik
Hidrofilik
Supernatan adalah protein yang terlarut bersama dengan larutan buffer
Isolat Protein
Produk turunan yang memiliki kandungan protein hingga 90% dalam berat kering
Faktor yang mempengaruhi
Suhu
Sinar ultraviolet
Tekanan
(surface denaturation)
Perubahan PH
Larutan Garam
Tahapan isolasi protein
Penghancuran sel (lisis sel)
Pemisahan partikel tertentu dari suspensi melalui sentrifugasi atau tahap penggumpalan (koagulasi)
Metode
Salting Out
Ekstrasi Protein
Elektroforesis
y = bX + a
Pembuatan Protein Standar
1000 ppm = 1 mg/ 1 ml ~ 0,5 mg BSA
2000 ppm = 2mg/1ml ~ 1mg BSA
3000 ppm = 3 mg/1ml ~ 1,5 mg BSA
4000 ppm = 4 mg/1 ml ~ 2 mg BSA
5000 ppm = 5 mg/1 ML ~ 2,5 mg BSA
6000 ppm = 6 mg/1 mL ~ 3 mg BSA
7000 ppm = 7 mg/1 mL ~ 3,5 mg BSA
Larut dalam air (memiliki molekul yang besar )
Mengalami koagulasi Karena pemanasan dan penambahan asam dan basa
Bersifat Amfoter karena terdapat ion Zwitter pada isoelektriknha sehingga mengalami koagulasi yang bisa dipisahkan dari pelarut nya
Sel Tumbuhan
dan Hewan.
Skema kerja perhitungan konsentrasi dengan metode Biuret
Menyiapkan sampel dan standar
siapkan serangkaian standar protein dengan konsentrasi mulai dari 0,5 hingga 10mg/ml sehingga volume akhir untuk pengujian tersebut adalah 0,5ml
persiapkan sampel dengan cara yang sama sehingga volume akhirnya adalah 0,5ml
nyalakan genova dan biarkan memanas
tambahkan 2,5ml reagen biuret ke setiap ampel dan standar, vortex,dan biarkan selama 30menit
transfer sampel ke kuvet dan ukur absorbansi pada 540nm menggunakan mode protein biuret pada genova
Menyiapkan reagen biuret
simpan dalam wadah plastik ditempat gelap. buang jika terlihat endapan hitam atau kemerahan
larutkan 1,5g tembaga II sulfat pentahidrat dan 6g natrium kalium tartrat dalam 500ml air
tambahkan 300ml 10%(w/v) NaOH dan ubah volumenya menjadi 1liter dengan air
tambahkan 1g kalium iodide untuk menghambat reduksi tembaga
Pengendapan dapat dilakukan dengan penambahan zat kimia tertentu, yaitu garam netral seperti annomonium sulfat (salting out), pelarut organik seperti aseton dan ethanol atau zat pengendap atau asam trikloroasetat
Skema Kerja
Pada proses lisis membran sel dan organel akan dihasilkan senyawa kontaminan fenolat dan protease yang dapat mendegradasi protein
Penggunaan detergen dapat meningkatkan kelarutan protein, khususnya pada protein yang sulit diekstraksi seperti protein membran dan protein inti. namun protein perlu dihilangkan segera karena dapat menghambat proses analisis selanjutnya
Plant Tissue (leaf 0,5 g. root 1,5 g)
Centrifuge
1. Discard supernatant
washing
Drying and storing
2.Supernatan
Homogenize with phenol
centrifuge
Precipitation
Drying and storing
Metode B
0,7 M Source, 0,5 Tris, 50 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2% B-ME, Phenol pH 7,5 :check: :check:
Metode C
10% TCA, 0.07% B-ME in acetone P.A
Metode A
:
100 mM Tris, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 Mm PMSF, TCA in Acetone pH 8,5
precipitation
Centrifuge
washing
drying and storing
Homogenize with extraction buffer
Powdering with liquid nitrogen and 10% PVPP
Tujuan dari isolasi adalah untuk mendapatkan protein dengan tingkat kemurnian yang tinggi sehingga dapat dilakukan analisa lebih lanjut,seperti mengetahui karakteristik khas protein tersebut,termasuk ukuran, bentuk, muatan, hingga fungsi
Untuk memisahkan komponen protein dari bahan utamanya
Tidak ramah lingkungan dan bersifat korosif pada bahan aluminium steel
Tidak bisa dilakukan pada skala yang lebih besar
Proses pemurnian protein menggunakan garam
Pada proses elektroforesis ini selain menggunakan medan listrik, digunakan gel elektroforesis berupa gel poliakrilamida yang bertujuan untuk memisahkan protein dengan koloid.
Kelompok H2
Nabila Dhafa Widyagusta/110120045
Ficky Firmansyah Fedorova/110120054
Divia Sukma Zerlinda/110120057
Rumus :fire:
Y= absorbansi
X = konsentrasi
Yang perlu diperhatikan
Suhu
Kelarutan pelarut
Ph
Yang perlu diperhatikan
Suhu 4°C
Larutan buffer
Ph
Dengan perlakuan mekanik dan kimiawi
Menggunakan Sodium Duodecyl Sulphate atau bisa disebut juga dengan SDS-PAGE
Tujuan
Sifat dan Jenis Protein
Sel Tumbuhan
Sel Hewan
Hasil Analisis Kualitas protein dengan elektroforesis 1 dimensi
Dari ketiga hasil diatas,hasil yang paling sesuai adalah metode C yaitu pengendapan TCA-aseton yang menghasilkan 11pita yang lebih jelas namun smearnya masih ada (terlihat ) tetapi minimal
Hasil Perhitungan kuantitas protein dengan spektrofotometer
Sel
https://www.youtube.com/watch?v=ZWw_-H1cMvk
Isolasi Protein dengan Western Blot
