Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Amplifikasi DNA Dengan PCR, Alur pemeriksaan, mesin pcr, image, image,…
Amplifikasi DNA Dengan PCR
Definisi & History
Metode pertama kali diajukan oleh H.G. Khorana & tim pada tahun 1971
Pada tahun 1983 pertama kali dikembangkan oleh Dr. Karry Mullis
( CETUS corporation )
Saiki et al. (1988) - DNA Polymerase
( Taq, Thermus aquaticus )
PCR terpilih menjadi major Scientific Development (1989) & Taq DNA Polymerase menjadi molecule of the year
( Science Magazine )
Karry B.Mulis menerima hadiah Nobel, dibanding kimia (1993)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Proses sintesis enzimatis untuk melipat gandakan
( mengamplifikasi ) nukleotida
( DNA / RNA ) secara eksponensial dengan teknik invitro.
Nama instrumen : Thermocycler, Gene cycler
Jenis PCR
Digital PCR (dPCR)
Digital PCR (dPCR) adalah teknik revolusioner untuk mengukur asam nukleat secara tepat.
Real-Time PCR
(Quantitative PCR/qPCR)
hasil PCR dapat analisis secara kuantitatif
In situ PCR
PCR in situ adalah teknik yang menggabungkan sensitivitas ekstrim PCR dengan lokalisasi seluler yang disediakan oleh hibridisasi in situ (ISH)
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
Prosesnya menggunakan sampel RNA untuk membuar cDNA
Nested PCR
Merupakan salah satu teknik variasi PCR yang menggunakan dua pasang primer dengan spesifisitas yang berbeda
Reverse Transcriptase real time PCR
(RT-qPCR)
Untuk proses amplifikasi RNA
Allele-Specific PCR
Metode PCr yang dapat mendeteksi terjadinya mutasi pada sel DNA manusia dalam DNA template
Touch down (TD) PCR
Metode PCR yang lebih spesifik yang menggunakan cycling program dimana suhu annealing akan dikurangi perlahan-lahan sampai pada suhu yang optimal
Multiplex PCR
Memungkinkan amplifikasi beberapa target berbeda dalam satu tube PSC secara bersamaan
Nanoparticle-assisted PCR
(nanoPCR)
metode untuk amplifikasi DNA yang cepat dan telah diadopsi untuk mendeteksi virus karena kesederhanaan, kecepatan, dan spesifisitasnya.
Conventional PCR
dasar dari semua tipe PCR
Alu PCR
Alu PCR adalah teknik "sidik jari DNA" yang cepat dan mudah dilakukan berdasarkan analisis simultan
Aplikasi PCR dalam Identifikasi SARS-CoV-2
OTG/ODP/PDP
Rapid Test -
Real time PCR/TCM SARS-CoV-2 Swab/Sputum 2x (2 hari berturut-turut
Terkonfirmasi covid-19
Negatif Covid-19
Rapid Test +
Isolasi diri, 10 hari kemudian ulangi rapid test
Rapid test ulang
Positif Covid-19
Real time PCR/TCM SARS-CoV-2 Swab/Sputum 2x (2 hari berturut-turut
Negatif Covid-19
Terkonfirmasi covid-19
Gejala
Tanpa Gejala
1 more item...
Sedang
1 more item...
Ringan
1 more item...
Berat
1 more item...
Negatif Covid-19
https://youtu.be/ThG_02miq-4
Siklus PCR
Tahap Denaturasi (Denaturation) Pemisahan untaian DNA template
(suhu 92-95° C; waktu 1-2 menit)
Tahap Penempelan Primer (Annealing)
Penempelan primer untuk sintesis rantai
DNA
(suhu 55° C; waktu 1-2 menit)
Tahap Pemanjangan (Polimerisasi)
Proses sintesis untai baru DNA yang dikatalisa oleh enzim DNA polimerase yang memiliki sifat tahan panas (thermostable)
(suhu 70-72° C; waktu 30 detik-22 menit
Web oligoanalyzer untuk menghitung melting temperature dan suhu annealing (dikurangi 5 C dari melt temp)
https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer
Web biotools untuk menghitung ukuran DNA
http://biotools.nubic.northwestern.edu/SizeCalc.html
Komponen PCR
Persiapan Sampel
PCR
Elektroforesis
Buat gel Agarosa
Letakkan gel dan cetakan ke dalam alat
Tuangkan TAE dan TBE pada alat dan gel
Injeksikan sampel marker ke dalam well
Hubungkan kabel dengan power supply
Elektroforesis dijalankan pada 70-100 volt
1 more item...
Identifikasi Hasil
Hasil diidentifikasi menggunakan GelDoc Analysis Biorad
Alat dinyalakan dengan menekan tombol power
Buat protocol baru dengan menekan New Protocol pada home screen lalu tekan save
Masukkan sampel PCR
Sentuh Run pada protokol
Setelah ada bunyi alarm lid temperature ditunggu hingga mencapai 4 C
Buka tutup alat, kemudian hasil dapat dilanjutkan dengan visualisasi hasil menggunakan metode elektroforesis
Vortex dan Spin
6 bahan utama
DNA Template (sebagai bahan dasar yang akan diuji)
Primer Forward & reverse ( untuk mengawali sintesis rantai DNA)
Ion MgCl2 (Sebagai kofaktor enzim polimerase)
Taq DNA Polimerase (katalis reaksi enzimatis sintesis rantai DNA)
PCR Buffer ( menjaga pH 8,3 dan kekuatan ionik yang optimum bagi kerja enzim polimerase)
dNTPs ( sebagai monomer penyusun rantai DNA)
https://youtu.be/iQsu3Kz9NYo
Keunggulan PCR
Relatif Cepat, copy fragmen DNA 200.000 kali, 20 siklus, selama 220 menit
Sensitif > jumlah DNA yang akan dicopy sangat sedikit (5µg)
Total volume rendah > 25-50µl
Otomatis, Akurat, dan Spesifik > Thermocycler secara tepat
Aplikasi PCR
Plant DNA Barcode
Identifikasi Polimorfisme DNA
Genomoc workflow
Sampling
Ekstraksi DNA dengan NucleoSpin Plant ll
Amplifikasi daerah ITS [1]
Sequencing
Analisis Filogenetik
Kelemahan PCR
Kualitas (Kemurnian) DNA sangat berpengaruh terhadap hasil PCR proses amplifikasi memerlukan urutan (Sequence) DNA untuk mendesain primer, kecuali AluPCR, RAPD. Perlu skill khusus untuk Operaator & Kemampuan analisis data
Alur pemeriksaan
Kelompok H-1
Aloysius Jeffrey S. (110120040)
Irene Suwandi (110120041)
Raccel Aracely F.H. (110120044)
