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构建γ-globin表达调控报告细胞系 - Coggle Diagram
构建γ-globin表达调控报告细胞系
质粒构建
设计gRNA
构建gRNA(SaCas9)表达质粒
检测gRNA切割效率
设计Donor序列
Donor序列构建到可通读的质粒上
转染293T
检测Donor序列是否正常工作（GFP阳性细胞数，SEAP表达）
Donor序列构建到Donor质粒上（PSK）
CRISPR activator质粒构建
检测BU，HU, Hemin对γ-globin的激活效率。
目标基因型单克隆进一步基因型鉴定
Sanger-seq
ddPCR
CRISPR脱靶检测
方法学建立
方案一：SaCas9质粒，Donor质粒转染293T。
PCR跨同源臂鉴定混合克隆基因型
方案二：席师兄之前的策略建立
PCR跨同源臂鉴定混合克隆基因型
构建报告细胞系
方案一： 电转SaCas9质粒，Donor质粒
按GFP阳性分单克隆（检测GFP阳性比例）
单克隆基因型鉴定
PCR跨同源臂鉴定混合克隆基因型
检测SEAP表达量
加HU诱导HBG2表达4天后（检测GFP阳性比例）
按GFP阳性分单克隆
单克隆基因型鉴定
PCR跨同源臂鉴定混合克隆基因型
检测SEAP表达量
方案二：采用席师兄之前的策略
按mcherry阳性分单克隆
单克隆基因型鉴定
检测SEAP表达量
PCR跨同源臂鉴定混合克隆基因型
目标基因型单克隆分子表型表征
加HU，BU， Hemin等检测培养
检测报告基因表达量
检测HBG2表达量 （SEAP的表达量和HBG2的表达量成正相关）
证明报告细胞系时候高通量筛选使用，并结合我之前的研究
做实验前 要找 昊堃师兄 陈老师帮我过一遍细节