ANALISIS PROTEIN
DENGAN
ELEKTROFORESIS
Metode Dasar Isolasi Protein
Tahap Isolasi Protein
- penggumpalan (koagulasi)
- lisis sel
Ekstraksi Protein
Salting Out
metode akan berbeda pada setiap jenis
sampel mahluk hidup yang digunakan.
pemisahan parikel tertentu melalui sentrifugasi
Elektroforesis (SDS-PAGE)
Prosedur Praktikum
metode lisis lainnya dapat dilakukan secara fisik dengan kombinasi metode pengenceran atau dialisis untuk menghilangkan enzim kontaminan.
pada proses lisis membran sel dan organel akan dihasilkan senyawa kontainan fenolat dan proteinase yang dapat mendegradasi protein
- Metode Pengendapan TCA-aseton
Alur Kerja Analisis Protein Secara Umum
Analisis Kualitatif
Analisis Kuantitatif
Pemurnian Protein
pada pemisahan, partikel yang densitasnya lebih tinggi daripada pelarut turun (sedimentasi) dan partikel yang lebih ringan mengapung ke atas.
proses sentrifugasi akan memisahkan bagian debris dengan makromolekul protein sel.
Isolasi Protein
Sentrifugasi diferensial : Presipitasi garam diferensial,Presipitasi pelarut diferensial,Elektroforesis preparatif (1D
& 2D),Kromatografi kolom
Elektroforesis 1D/2D : Imunoelektroforesis, Uji reaksi berbasis warna: Biuret, Dradford, Ninhidrin, Xanthoproteic
tes asam
- Metode Tris-aseton-fenol
Pada proses ini dilakukan purifikasi menggunakan metode fraksinasi, larutan protein akan ditambahkan garam hingga larutan tersebut menjadi jenuh sehingga terjadi pengendapan.
Pada proses ini bertujuan untuk memisahkan komponen protein dari bahan utamanya. Ekstraksi protein dilakukan dengan menggunakan metode lisis.
Pada proses ini protein akan dipisahkan sesuai dengan berat molekul dan affinitas tertentu dengan menggunakan medan listrik dan gel poliakrilamida yang bertujuan untuk memisahkan protein dengan koloid.
Analisis Kualitatif Protein
2 D Elektroforesis
1 D Elektroforesis
Spektrometri massa : Penyerapan pada 280 nm , metode : Metode Biuret ,Metode Lowry ,Metode BSA,Metode Bradford
Pengertian
Isolasi protein adalah suatu tahapan yang paling penting dalam penelitian molekuler untuk mengetahui fungsi protein sebagai hasil ekspresi proses sintesis DNA.
pemisahan protein terutama dilakukan : elektroforesis gel polikrilamida
metode pemisahan berdasarkan sifat berat dan muatan molekulnya
Tujuan
Tujuannya untuk mendapatkan protein dengan tingkat kemurnian yang tinggi sehingga dapat dilakukan analisa lebih lanjut, seperti mengetahui karakteristik khas protein tersebut, termasuk ukuran, bentuk, muatan, hingga fungsi.
molekul dengan berat rendah bermigrasi lebih cepat dalam gel dibandingan dengan protein dengan berat molekul tinggi
Kekurangan : biaya teknik ini jauh lebih tinggi dibandingkan elektroforesis 1D
metode ini meningkatkan resolusi pemisahan protein
western blotting
titik iso-elektrik protein bergantung pada pH dimana protein tersebut netral
Memisahkan protein berdasarkan 2 sifat titik isolistrik protein dan berat molekul
molecule detected : protein
gel electrophoresis : gel polycrylammide
probes : antibody promer
blotting method : transfer melalui elektrik
detection system : chemiluminescent colorimetric
gel pretreatment : -
- Metode Pengendapan Trizol
berbasis kimia: TCA, Fenol, TriZol,
t-butanol, Kit berbasis kolom