ANALISIS PROTEIN
DENGAN
ELEKTROFORESIS

Metode Dasar Isolasi Protein

Tahap Isolasi Protein

  1. penggumpalan (koagulasi)
  1. lisis sel

Ekstraksi Protein

Salting Out

metode akan berbeda pada setiap jenis
sampel mahluk hidup yang digunakan.

pemisahan parikel tertentu melalui sentrifugasi

Elektroforesis (SDS-PAGE)

Prosedur Praktikum

metode lisis lainnya dapat dilakukan secara fisik dengan kombinasi metode pengenceran atau dialisis untuk menghilangkan enzim kontaminan.

pada proses lisis membran sel dan organel akan dihasilkan senyawa kontainan fenolat dan proteinase yang dapat mendegradasi protein

  1. Metode Pengendapan TCA-aseton

Alur Kerja Analisis Protein Secara Umum

Analisis Kualitatif

Analisis Kuantitatif

Pemurnian Protein

pada pemisahan, partikel yang densitasnya lebih tinggi daripada pelarut turun (sedimentasi) dan partikel yang lebih ringan mengapung ke atas.

proses sentrifugasi akan memisahkan bagian debris dengan makromolekul protein sel.

Isolasi Protein

Sentrifugasi diferensial : Presipitasi garam diferensial,Presipitasi pelarut diferensial,Elektroforesis preparatif (1D
& 2D),Kromatografi kolom

Elektroforesis 1D/2D : Imunoelektroforesis, Uji reaksi berbasis warna: Biuret, Dradford, Ninhidrin, Xanthoproteic
tes asam

  1. Metode Tris-aseton-fenol

Pada proses ini dilakukan purifikasi menggunakan metode fraksinasi, larutan protein akan ditambahkan garam hingga larutan tersebut menjadi jenuh sehingga terjadi pengendapan.

Pada proses ini bertujuan untuk memisahkan komponen protein dari bahan utamanya. Ekstraksi protein dilakukan dengan menggunakan metode lisis.

Pada proses ini protein akan dipisahkan sesuai dengan berat molekul dan affinitas tertentu dengan menggunakan medan listrik dan gel poliakrilamida yang bertujuan untuk memisahkan protein dengan koloid.

Analisis Kualitatif Protein

2 D Elektroforesis

IMG_5220

1 D Elektroforesis

Spektrometri massa : Penyerapan pada 280 nm , metode : Metode Biuret ,Metode Lowry ,Metode BSA,Metode Bradford

Pengertian

Isolasi protein adalah suatu tahapan yang paling penting dalam penelitian molekuler untuk mengetahui fungsi protein sebagai hasil ekspresi proses sintesis DNA.

pemisahan protein terutama dilakukan : elektroforesis gel polikrilamida

metode pemisahan berdasarkan sifat berat dan muatan molekulnya

Tujuan

Tujuannya untuk mendapatkan protein dengan tingkat kemurnian yang tinggi sehingga dapat dilakukan analisa lebih lanjut, seperti mengetahui karakteristik khas protein tersebut, termasuk ukuran, bentuk, muatan, hingga fungsi.

molekul dengan berat rendah bermigrasi lebih cepat dalam gel dibandingan dengan protein dengan berat molekul tinggi

Kekurangan : biaya teknik ini jauh lebih tinggi dibandingkan elektroforesis 1D

metode ini meningkatkan resolusi pemisahan protein

western blotting

titik iso-elektrik protein bergantung pada pH dimana protein tersebut netral

Memisahkan protein berdasarkan 2 sifat titik isolistrik protein dan berat molekul

molecule detected : protein

gel electrophoresis : gel polycrylammide

probes : antibody promer

blotting method : transfer melalui elektrik

detection system : chemiluminescent colorimetric

gel pretreatment : -

  1. Metode Pengendapan Trizol

IMG_5219

berbasis kimia: TCA, Fenol, TriZol,
t-butanol, Kit berbasis kolom