Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

Les 1: Deel 11.1 en 11.2 editie 15 - Coggle Diagram

- - - - Het DNA van het desbetreffende organismen wordt geïsoleerd in pure vorm.
      - Dit wordt gedaan met behulp van Polymerase Chain Reaction (PCR)
        
        Dit is het vermeerderen of vermenigvuldigen van kleine stukjes DNA, en dit wordt amplification genoemd. Elke ronde van amplification wordt het DNA verdubbeld. De groei is dus exponentieel.
        
        PCR machine doet het werk is een snellere tijd. Deze machine wordt een thermocycler genoemd.
        
        Soms is het nodig om de hoeveelheid DNA te meten, dit wordt gedaan met quantitative PCR (qPCR).
        
        PCR heeft DNA-polymerase nodig. DNA-polymerase kopieert DNA moleculen. Ook dient polymerase als een primer. Een primer is een stukje DNA dat DNA maakt.
        
        Stappenplan hoe PCR wordt gedaan?
        
        Template streng van DNA wordt gedenatureerd door het heet te maken en door oligonucleotide primers toe te voegen in overmaat. Deze primers zorgen ervoor dat de template strengen aan een primer binden, en niet aan elkaar wanneer het mengsel afkoelt.
        
        DNA polymerase maakt de primer langer door gebruik te maken van de originele DNA als een template.
        
        Na een incubatie periode worden de strenge weer verhit om uit elkaar te halen. Het doel gen (target gene) is nu aanwezig in twee keer de originele hoeveelheid. Het mengsel wordt dan gekoeld zodat de primers mengen met complementaire stukjes van nieuw gesynthetiseerde en originele DNA. Dit proces herhaald zich.
        
        Hoge temperaturen worden gebruikt om het denatureren van dubbelstrengs DNA plaats te laten vinden. De DNA polymerase moet tegen hitte kunnen en zo een DNA polymerase wordt dan thermostabiele DNA genoemd. Een thermostabiele DNA is Taq Polymerase. Dit is afkomstig van de bacterie Thermus Aquanticus. Een bacterie/ polymerase die tegen hogere temperaturen kan is Pfu polymerase. Pfu heeft ook iets dat proofreading heet. Hierdoor kijkt het de DNA stenen na en maakt het zelden fouten en verbeterd het de fouten juist. Omdat deze thermostabiele genen zo belangrijk zijn worden ze meestal in E.Coli geplant en E.coli kopieert dit heel vaak.
        
        PCR kopieert NIET het hele DNA, maar alleen stukjes DNA die het vermenigvuldig (dit wordt target DNA genoemd, omdat dat het uiteindelijke stuk is dat PCR moet hebben) vanuit de template DNA (gehelde streng DNA).
        
        PCR is erg belangrijk voor het verkrijgen van DNA voor gen kloneren. De genen kunnen met behulp van PCR in grote aantallen verkregen. Ook kan er een speciaal stukje gen gepakt worden en in grote aantallen verkregen worden, omdat dit een speciale code heeft. Hierdoor is herkent. Met deze techniek kan bijvoorbeeld een mysterie of moordzaak opgelost worden.
        
        RT-PCR
        
        Staat voor reverse transcriptie.
        
        Deze techniek wordt gebruikt om DNA te maken van een mRNA template.
        
        Deze methode wordt gebruikt om te detecteren of een gen expressie vertoont.
        
        RT-PCR gebruikt het enzym reverse transcriptase om RNA om te zetten in complementair DNA (cDNA). cDNA heeft geen introns. Een intron is een stukje DNA aan het einde van een gen, maar niet wordt gebruikt om het eiwit te coderen.
        
        om cDNA te maken, wordt een primer die complementair is aan de 3 en van het doel-RNA door het enzym reverse transcriptase gebruikt om de RNA-synthese op gang te brengen.
        
        Als de template eukaryoot mRNA is, kan een primer die complementair is aan de poly A-staart van het mRNA worden gebruikt. De activiteit van reverse transcriptase resulteert in een hybride nucleïnezuurmolecuul dat zowel DNA als RNA bevat. RNase H, een ribonuclease dat specifiek is voor het hybride molecuul, hydrolyseert het RNA, waardoor het enkelstrengige cDNA overblijft als sjabloon voor standaard PCR met behulp van een aanvullende primer die complementair is aan het 5-uiteinde.
        
        Gel elektroforese en nucleic zuur hybridisatie
        
        Om te kijken of DNA amplificatie van een nucleinezuur succesvol was wordt er gebruik gemaakt van gelelektroforese. Dit is een techniek waardoor DNA of RNA deeltjes gescheiden kunnen worden op grond van deeltjes grootte en lading.
        
        Wanneer op de agarose gel een elektrische stroom is aangesloten bewegen de nucleïne zuurtjes door de gel naar de positieve pool, omdat DNA negatief is (met name de fosfaatgroepen in DNA). Kleine DNA of RNA fragmenten bewegen sneller door de gel en zijn dus verder in de gel. Grote deeltjes gaan langzamer en komen minder ver in de gel.
        
        Nadat de gel voor een tijde heeft gerund, zodat de moleculen gescheiden zijn, wordt de agarose gel gekleurd met ethidium bromide. De bromide bindt aan nucleinezuren en laat hun fluoriseren (licht geven).
        
        Om de grootte van het DNA of RNA te bepalen wordt de migratie (bewegingssnelheid in gel) vergeleken met een standaard sample dat nucleinezuur bevat waarvan de deeltjesgrootte al bekend is. Deze standaard sample wordt een ladder genoemd. DNA fragmenten kunnen hierdoor gezuiverd worden van de gel en gebruikt worden voor verscheidene doeleinden zoals kloneren of hybridizatie.
        
        Wanneer DNA gedenatureerd is (twee stranden gaan uit elkaar) kan een single strand gebruikt worden om hybride dubbel-stranded moleculen te vormen met andere single-stranden DNA of RNA moleculen met behulp van complementaire base paring (AT en GC). Dit proces wordt hybridizatie genoemd. Hybridizatie word wereldwijd gebruikt om stukjes DNA en RNA te identificeren.
        
        Single-stranded nucleïnezuren van wie de identiteit al bekend is en die gebruikt worden in hybridizatie worden (nucleïnezuur) probes genoemd. Om DNA te detecteren worden probes radioactief gemaakt of gelabeld met chemische stoffen die kleuring veroorzaken.
        
        Hybridisatie is bruikbaar voor het vinden van gerelateerde sequencies. Ook wordt hybridisatie gebruikt om te kijken of een gen expressie vertoont in RNA transcript. In een Southern blot worden probes van bekende sequencies gehybridiseerd tot doel DNA fragmenten die gescheiden zijn door gelelektroforese. Het doel van een Southern blot is om een specifiek stukje DNA sequencie (volgorde) te bepalen.
        
        De hybridisatieprocedure waarbij DNA de doelsequentie in de gel is en RNA of DNA de probe is, wordt een Southern-blot genoemd. Daarentegen gebruikt een Northern-blot RNA als de doelsequentie en DNA of RNA als de probe om genexpressie te detecteren.
      - Een vorm van DNA manipulatie