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Secuenciación de ADN - Coggle Diagram
Secuenciación de ADN
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Pirosecuenciación
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El ADN se desnaturaliza para obtener ADN monocatenario y se hibridará con un cebador. En el tubo de reacción se encontrarán las enzimas luciferasa, ATP sulfurilasa, ADN polimerasa y apirasa además de los sustratos luciferina y adenosín-5-fosfosulfato (APS).
A continuación se añaden los nucleótidos uno después del otro, al contrario que en una reacción de secuenciación normal donde se añaden todos a la vez.
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Permite la detección de cuasiespecies minoritarias con capacidad discriminatoria para detectar variantes virales que representan tan solo el 1 % de la población,14 incluyendo a poblaciones virales menores al 20 % resistentes a las drogas de aquellos pacientes con fallo a la terapia.
La pirosecuenciación es un método de síntesis, porque la secuencia del molde se determina a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Para determinar cuál es la base que se añade durante la síntesis se lleva a cabo, en riguroso orden, una serie de reacciones enzimáticas
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Método de Sanger
Fred Sanger en 1977
Es un método enzimático que permite determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria.
Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.
Este método se originó en el estudio de las interacciones entre ADN y proteínas (huella genética), estructura de los ácidos nucleicos y modificaciones epigenéticas del ADN,
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Esta técnica se basa en la escisión específica de bases nitrogenadas en la cadena de ADN y la posterior ruptura de la cadena de ADN en el sitio de la escisión de la b ase nitrogenada debido a su mayor fragilidad.
La primera versión del método de Sanger se publicó inicialmente en 1957 y fue completado en 1977 con el uso de didesoxinuclueótidos terminadores
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