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AULA 7: Contagem de estafilococos coagulase positiva, Adicionar 1 mL de…
AULA 7: Contagem de estafilococos coagulase positiva
:female-scientist::skin-tone-2: Início da prática
Fazer desinfecção da embalagem (álcool 70%)
Na balança usar: saqueta, béquer
:warning: Tarar a balança antes de pesar a amostra!
Pesar 25g de amostra
:warning: Amostragem homogênea, coletar de todas as partes da amostra.
Adicionar 225 mL de água peptonada 0,1%
LEVAR SAQUETA PARA HOMOGENEIZAÇÃO (2min)
:diamonds:Fazer diluições
FAZER SEMEADURAS
:star2: INOCULAÇÃO EM SUPERFÍCIE
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1) Pipetar 1 mL da saqueta e adicionar ao tubo com 9 ml de água peptonada
HOMOGENEIZAR
1 more item...
Adicionar 1 mL de cada diluição em tubos de caldo LST
:fire:Incubar os tubos a 35°C por 24-48h.
:eyes:Observar resultados
RESULTADO PRESUNTIVO: Positivo com formação de gás no tubo de Durham e turvação do LST
Inocular uma alçada em caldo E. coli (EC) para coliformes tolerantes; incubar a 44,5ºC por 48h
:warning: Observar se houve ou não formação de gás em ambos os caldos para cada uma das diluições. Contar quantos tubos deram positivos para cada diluição
Inocular uma alçada do caldo EC positivo por esgotamento em superfície de ágar EMB
:fire:Incubar placas a 37°C por 24-48h.
Semear colônias típicas de E. coli do EMB em BHI
Inocular uma alçada em caldo verde brilhante (VB) para coliformes totais; incubar a 35ºC por 48h
:warning: Em triplicata
:warning:TUBO DE DURHAM é usado para observar a formação de gás
:fire: Incubar em condições não seletivas a 35ºC por 18-24h
:explode: ENRIQUECIMENTO
:white_small_square:0,1 mL do cultivo + 10 mL de meio Rappaport Vassiliadis (RV); Incubar a 41,5ºC por 24h
Semear em meio XLD
Semear em meio BPLS
:white_small_square:1 mL do cultivo + 10 mL do caldo Tetrationato (TT); Incubar a 37ºC por 24h
Semear em meio BPLS
Semear em meio XLD
:warning:Caldo TT pode ter variações em sua formulação, com a adição de outros inibidores.
Desinfecção
:fire:Incubar a 35-37ºC por 24h
Salmonella em meio BPLS: Colônia rosa rodeada com zona vermelha (lactose e sacarose negativo)
Salmonella em meio XLD: meio rosa com colônias que podem produzir ácido sulfúrico e apresentarem coloração preta.
Escolher 5 colônias típicas, obtidas no plaqueamento e passar para BHI
:warning: Não seletivo, apenas para crescimento de colônias boas e puras.
:fire: Incubar a 35ºC por 24h
Fazer triagem bioquímica
TSI e LIA
Inocular colônia suspeita através de picada (anaerobiose) e estrias na rampa (aerobiose).
Incubar a 35-37ºC por 24h.
URÉIA
Inocular colônia suspeita através de estriamento na superfície.
Incubar a 35-37ºC por 24h.
FAZER INOCULAÇÃO EM PLACA
:star2: INOCULAÇÃO EM PROFUNDIDADE (mesófilos)
Inoculação em placas
:no_entry: Depois de pipetar, em cada placa adicionar aproximadamente 20 mL de ágar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG) a 45 °C em cada placa contendo o inóculo
:no_entry: Para homogeneizar o inóluco e o ágar, fazer leves movimentos de "8" por 8 vezes.
Esperar meio solidificar
Incubar as placas invertidas a 27°C por 24h.
Escolher 5 colônias típicas, obtidas no VRBG e passar para BHI
:warning: BHI:Não seletivo, apenas para crescimento de colônias boas e puras; Incubar a 35ºC por 24h.
Teste de fermentação (via anaeróbia e oxidativa
:warning: As enterobactérias fermentam em ambos os ambientes, ocorre a viragem do pH do meio para ácido e o meio vai da cor verde para o amarelo
Teste de Oxidase
:warning:Todas as enterobactérias são oxidase negativa
Algumas bactérias produzem azul de indofenol a partir da oxidação de dimetil p-fenilenodiamina e a-naftol na presença da enzima citocromo oxidase.
:warning: VRBG: seletivo e diferencial para enterobactérias
DILUIÇÃO 10^-3
Adicionar 1 mL em placa de petri (2x)
DILUIÇÃO 10^-2
Adicionar 1 mL em placa de petri (2x)
DILUIÇÃO 10^-1
Adicionar 1 mL em placa de petri (2x)
:warning: Deve ser feito em DUPLICATA, São 6 placas de petri, duas para cada diluição.
:red_flag: Fazer Teste de beta-hemólise
Escolher 5 colônias típicas obtidas na cultura de ágar MYP
Inocular em ágar sangue por picada ou estriamento.
Incubar as placas em 30-32ºC por 24 horas.
Bacillus cereus
é positivo para beta-hemólise o que diferencia ele de outros bacilos que não são hemolíticos.