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Fluxograma das aulas práticas demonstrativas - Coggle Diagram

- - - - Contagem total de aeróbios mesófilos totais e psicrotróficos
        
        Contagem de Psicrotróficos em Placas
        
        Plaqueamento em superfície
        
        1° Inoculação:
        
        A inoculação acontece no meio de cultura solidificado, vou adicionar o inoculo em cima do meio de cultura. Todas as diluições terão duplicatas.
        
        Em uma placa que já tem o meio de cultura vou adicional 0,1 ml de inoculo sobre o meio de cultura e vamos homogeneizar com a alça de drigalski estereo.
        
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        2° Contagem das colônias:
        
        Deve se considerar a placa com colônias na faixa de 25-250, deve-se fazer a média desses dois resultados, se obtém a contagem das colônias. Contudo, precisamos multiplicar o resultado por 10, pois utilizamos uma quantidade 10x menos que a anterior, e multiplicamos também pelo fator de diluição.
        
        Contagem das placas:
        
        10-3: 350 e 302 colônias.
        
        10-4: 82 e 114 colônias.
        
        10-5: 1 e 3 colônias.
        
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        Contagem Total de Mesófilos Aeróbios
        
        Semeadura em profundidade:
        
        1°Inoculação:
        
        Despejar o meio de cultura na placa, em torno de 20 ml de ágar PCA para cobrir o fundo, com 1 ml de cada diluição (10-1, 10-2, 10-3...). Serão realizadas duas placas para cada diluição. Homogeneizar com 8 movimentos na forma de ''8'' com a placa (observar se o liquido está se movendo) e deixar o meio de cultura parado até solidificar .
        
        Incubar a 35°-37° C de 24-48h, com as placas invertidas.
        
        2° Contagem das colônias:
        
        Deve se considerar a placa com colônias na faixa de 25-250, deve-se fazer a média desses dois resultados, se obtém a contagem das colônias. Multiplicamos também pelo fator de diluição.
        
        Contagem das placas:
        
        10-4: 402 e 498 colônias.
        
        10-5: 69 e 115 colônias.
        
        10-6: 5 e 15 colônias.
        
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        PCA (Plate Count Agar): ágar padrão de contagem, fundido na temperatura de 45° C (usado em plaqueamento em profundidade), acima vai inativar os microrganismos e abaixo ele vai solidificar (usado no plaqueamento em superfície). Não tem nenhum ingrediente na sua formulação que seja seletivo ou diferencial, possui nutrientes essenciais para todos os tipos de bactérias, é um ágar padrão. Permite levantamento da carga microbiana do alimento. Composto por triptona, extrato de levedura, glicose, ágar e água destilada. É recomendável utilizar o TCC pois deixa as colônias vermelhas, menos diluídas, diferenciar o que é colônia e o que é fragmento de alimento.
      - Contagem total de bolores e leveduras
        
        Plaqueamento em superfície
        
        Bolores e leveduras são sempre plaqueados em superfície, pois o contato com o oxigênio é maior e todos os bolores e leveduras são aeróbios. Além disso, em profundidade poderia injuriar, por isso se usa sempre em superfície. Não se plaqueia 10 na -1 a não ser que a amostra tenha uma contagem muito baixa (estimada), pois cresce muitas colônias.
        
        1° Inoculação:
        
        PDA: ágar mais antigo, estimula a produção de esporos em bolores e produção de pigmentos em alguns dermatófitos. Utilizasse o ác. tartárico e ác. lático para inibir crescimento microbiano. É constituído por infusão de batata, dextrose (fonte de carboidrato), ágar (para solidificar o meio) e água destilada.
        
        Fazer uma duplicada para cada diluição, com 100 microlitros em cada placa com ágar PDA ( ágar batata dextrose), espalhar alça de drigalski.
        
        Adicionar ácido tartárico a 10% para baixar o pH, pois preferem ambientes mais ácidos para se desenvolver. O pH de 3,5
        
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        Métodos ISO
        
        DRBC (ágar dicloran rosa bengala cloranfenicol): usado para alimentos acima de 0,95 AA (atividade de água). Inibe parcialmente o desenvolvimento da colônia, existem alguns gêneros que espalham na placa, e no batata eles dominam a placa muito rapidamente, e os outros fungo podem não se desenvolver. DRBC supre essa demanda dos espalhadores e retardam o desenvolvimento desses fungos. Dicloran e o rosa bengala retarda o crescimento dos fungos, que são os que tem normalmente o desenvolvimento rápido. Rosa de bengala é sensível a luz. Permite a detecção de outras leveduras e bolores que têm taxas de crescimento menores.
        
        DG18 (ágar dicloran glicerol): usado para alimentos abaixo de 0,95 AA (atividade de água), como geleias e farinhas. Dicloran também controla o crescimento das colônias, não deixa a placa ficar dominada por 1 ou 2 fungos. Possui glicerol a 16%, é o diferencial desse ágar, faz diminuir a atividade de água deste meio de cultura, os que precisam de agua mais baixa vão se desenvolver melhor. Clorofenicol é adicionado para inibição de bactérias, é um antibiótico de amplo espectro.
        
        2° Contagem das colônias:
        
        Opta por placas entre 15 a 150 colônias, bem menos que para bactérias, pois bolores e leveduras ficam bem grandes. Total da placa 1 e da placa 2 e fazer a média das duas, e a media usa no calculo final do resultados. Multiplica por 10 e pelo inverso da diluição 10-2 (fica 102), expressa UFC/g.
        
        Contagem das placas:
        
        10-2 (DRBC): total na placa 1 foi de 18 colônias e na placa 2 foi de 26 colônias.
        
        Média das duas placas: 22 x 10 na 2.
        Multiplicação por 10: 22X10X10 na 2= 2,2x10 na 4 UFC/g
        
        Petrifilm Bolores e Leveduras: motivo do uso, pois é muito mais rápido quantitativo para análise de alimentos e ambiente, cresce em apenas 48h, é aprovado pelos órgãos que regulam os testes microbiológicos. Gera produtividade e economia para as empresas.
        
        1° inocular a placa com 1mL de amostra e aplicar o difusor.
        
        2° Incubar em temperatura de 25-28°C
        
        3° Fazer a contagem das colônias.
      - Contagem de Bacillus cereus:
        
        Presuntivo pois algumas cepas podem se desenvolver no meio ágar MYP, essas cepas não estão presentes muito nos alimentos.
        
        Metodologia segue a ISO 7932:2016 (utiliza obrigatoriamente dois meios de cultura)
        
        Obrigatórias pela ISO
        
        Plaqueamento em superfície
        
        1° Ágar MYP: possui em sua composição extrato de carne bovina e peptona (fontes de nitrogênio, vitamina e carbono), manitol (fonte de carboidrato e a fermentação é detectada pelo indicador de pH vermelho de fenol, fermentação dele por bactérias resulta na produção de ác. e colônias amarelas, B. cereus é negativo para manitol--> colônias rosa ), emulsão de gema de ovo ( lectina-> lecitinase-> hidrolisa a lecitina e forma uma zona de precipitação branco ao redor das colônias-halo), polimixina B (inibe crescimento de outras bactérias). Ágar seletivo e diferencial.
        
        Adicionar 0,1 mL de diluído sobre a placa com ágar MYP e espalhar com alça de drigalski
        
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        2°Ágar sangue(continuação da análise)
        
        Estrias as 5 colônias selecionadas em ágar sangue, posso colocar até mais de uma cepa.
        
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        Testes complementares
        
        Testes bioquímicos para identificação
        
        Hidrólise de Amido:
        
        Fazer uma estria horizontal com a cultura suspeita, em placas contendo ágar amido;
        
        Encubar em 35°C por 24h;
        
        Adicionar solução de iodo (lugol), na placa com o cultivo;
        
        Teste positivo: meio cor púrpura/ azul com área incolor ao redor do crescimento-> zona de hidrólise;
        
        Amido é degradado em alfa-glicose (incolor) pelo iodo e pela alfa-amilase.
        
        São poucas bactérias que hidrolisam amido.
        
        Hidrólise da gelatina:
        
        Avaliar a capacidade do B. cereus de produzir a enzima gelatinase para degradar o colágeno (hidrolise da gelatina presente no meio);
        
        Incubar a cultura em tubos contendo caldo nutriente de gelatina;
        
        Incubar a 30°C por 24h, após colocar na geladeira e observar, se ficar liquida mesmo gelada é B. cereus.
        
        Redução de Nitrato:
        
        B.cereus reduz nitrato em nitrito, através da enzima nitrato-redutase;
        
        Adicionar 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 3 gotas de ác. sulfanílico 0,8%;
        
        Se reduzir de nitrato a nitrito adquire coloração rosa/vermelho, caso não ocorra, coloco zinco se não virar a cor é positivo.
        
        Voges-Proskauer (VP):
        
        *B. cereus é VP positivo, cor vermelho rosado);
        
        Adicionar VP no ágar e verificar se teve viragem de cor;
        
        Se ela consome glicose e transforma em diacetil, a arginina das peptonas mais diacetil troca a cor.
        
        Caldo vermelho de fenol 1% de glicose:
        
        Avaliar se fermenta glicose em anaerobiose;
        
        Inocular a colônia suspeita, cobre com óleo mineral. ele consegue se desenvolver;
        
        A cor muda para amarelo claro.
        
        Motilidade:
        
        Uma picada no centro do meio e deixa se desenvolver por 72h;
        
        Crecimento rizoide, como cabelinhos não é característica de *B.cereus (tem crescimento mais uniforme).
        
        Decomposição de Tirosina:
        
        É um aminoácido que quando é decomposto por *B. cereus, se vê uma zona clara/transparente abaixo da parte inclinada.
        
        Teste de resistência a lisozima:
        
        Lisozima é uma enzima que ataca a parede celular de gram positivas, com característica de terem uma parede mais grossa, ela precisa para liberar o material celular se utiliza essa enzima;
        
        B. cereus é resistente a lisozima mesmo sendo um gram positivo.
        
        Caldo nutriente com lisozima, se tem turvação é positivo para B. cereus pois ele cresce, consegue se multiplicar.
        
        Coloração de Endósporos:
        
        B. cereus produz esporos bacterianos extremamente resistentes, gram não diferencia tão bem, mas de endósporo, sim. Faz um esfregaço como se fosse fazer um gram, deixa secar, fixa, coloca verde de malaquita, esporos se coram de verde, lava com agua destilada, cobre com safranina de 20 segundos células vegetativas coram com uma maior rapidez, lavamos novamente, examina no microscópio, coram com safranina e os endosporos coram com verde de malquita.
      - Análise de Salmonella sp.
        
        Detecção de salmonela em alimentos é um problema. Se diferencia das demais análises, pois não queremos fazer a contagem e sim detectar a sua presença ou a sua ausência. Presença já faz com que o lote seja descartado, as vezes é necessário fazer a identificação do sorovar.
        
        Preferencialmente usam o método da ISO, que é do laboratório oficial e também usam o AFA. Alguns meios de cultura são o mesmo mas mudam os procedimentos. ISO 6579 mais usada internacionalmente.
        
        Detecção de Salmonella em alimentos
        
        2° Enriquecimento Seletivo:
        
        Adicional 1 ml do cultivo do pré- enriquecimento + 10 ml do caldo RV (Rappaport Vassiliadis):
        
        Incubar em 42 +ou- 0,2°C por 24h;
        
        Caldo de alta pressão osmótica (cloreto de magnésio), pH baixo (5,1), presença de verde de malaquita (bacteriostático), é um inibidor para algumas bactérias acima de 37°C.
        
        Adicional 1 ml do cultivo do pré- enriquecimento + 10 ml do caldo TT (Tetrationato):
        
        Incubar em 35 +ou- 1°C por 24h;
        
        Enriquecimento seletivo, restringe coliformes, alguns sorovares da Salmonella apresentam a enzima tetrationato-resutase (multiplicam-se no meio), mas pode se desenvolver Proteus spp pode interferir na detecção ( caldo tetrationato+ verde brilhante inibe Proteus)
        
        iodo- oxidação do tiosulfato de sódio com formação de tetrationato.
        
        Para inibir boa parte da microbiota que acompanha o alimento. Se recomenda a utilização de 2 meios seletivos.
        
        3° Plaqueamento e Diferencial:
        
        Promove o crescimento preferencial de colônias com características típicas que a distinguem das competidores, para posterior confirmação bioquímica.
        
        Os meios são inoculados através de um estriamento e incubados a 35-36°C por 24h, em ágar BPLS e XLD.
        
        Ágar BPLS (verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose):
        
        Meio seletivo e diferencial, possui lactose e sacarose (açucares dissacarídeos, que a Salmonella não fermenta), vermelho de fenol e outros agente inibidores ( bile, verde brilhante e novobiocina);
        
        As colonias de Salmonella são rosa rodeadas por zona vermelha, o que quer dizer que não possui lactose e sacarose;
        
        Quando crecem amarelas-esverdeadas rodeadas por zona amarela são sacarose ou lactose- positivas.
        
        Ágar XLD (ágar xilose lisina desoxicolato):
        
        *Salmonella não fermenta lactose nem sacarose, mas fermenta xilose, então vira o indicador (vermelho de fenol) para amarelo;
        
        Devido a produção de ácido, a aumento do pH pela descarboxilação da lisina, vermelho de fenol fica vermelho de novo (só que mais intenso);
        
        Produção de H2S varia de acordo com a espécie, pode produzir ou não, são colônias com o centro preto.
        
        Ágar Hektoen Enteric : consegue detectar também a formação de ácido sulfídrico com as cores pretas no ágar. Fusina inibe o crescimento de gram positivas. Salmonella e shigella não fermentam lactose. Azul de bromotimol que é o indicador de ph.
        
        Ágar Salmonella Shigella: que fermenta lactose vai ter colônias rosadas caso da E. coli, Salmonella e Shigella não fermentam (colônias transparentes). Centro negro em algumas como por exempro o Proteus com a produção de H2S..
        
        4° Identificação Bioquímica e Sorológica:
        
        Isolamento: selecionar 5 colônias típicas (bem isoladas), vamos passar ela para um ágar BHI ( meio de cultura para uma cultura boa e pura, sem interferências), a partir do BHI que deixamos por 24h a 35°C vamos fazer os testes bioquímicos e sorológicos.
        
        Identificação:
        
        Triagens bioquímicas: TSI, LIA, ureia;
        
        Testes bioquímicos: indol, VMVP, citrato, motilidade, dulcitol;
        
        Identificação Sorológica.
        
        TSI: ágar de 3 açucares, Salmonella não metaboliza lactose e sacarose. Inocula uma picada até o fundo com a agulha de platina, pega a cultura no BHI, ágar inclinado e vai estriando na superfície, visualizar a anaerobiose, presença de de ácido sulfídrico no meio e na superfície reação alcalina. Sempre incuba com a tampa frouxa, pela formação de gás. No bisel temos a degradação do substrato proteico, depois de consumir a glicose vai degradar o substrato proteico, vai formar amônia e fica mais rosado. Tiossulfato vai ser reduzido, com uma coloração negra. Fundo, reação anaeróbia, Salmonella vai consumir a glicose e formando alguns ácidos, vai haver uma viragem do indicador para o amarelo. Incuba a 35-37°C por 24h.
        
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        ÁGAR LISINA: inclinado, inocula da mesma forma que o TSI. A Salmonela faz a descarboxilação da lisina, meio fica alcalino, mesmo ocorrendo a fermentação da glicose, não tem alteração de cor. Incuba a 35-37°C por 24h.
        
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        ÁGAR UREIA: inocula na superfície com alça ou agulha, estria em cima na rampa e incuba por 24h de 35-37 °C. Tem ureia como substrato e indicador, se produz a urease ou não, Salmonella não produz essa enzima, Proteus produzem e deixa o meio com pH mais alto e fica rosa.
        
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        Indol (-):capaz de produzir Triptofanase, produz indol e ácido pirúvico e mais amônia. Cor vermelha no superior do tubo positivo, Salmonella é indol negativo;
        
        VM (+): são capazes de produzir ácido a partir da glicose ou não, em torno de pH 6 é negativo, Salmonella fermenta glicose (maioria delas) é positiva (vermelho);
        
        VP (-): reagente age sobre o grupo guanidina, Salmonella não produz acetoina (negativa), positiva tem coloração vermelho-cereja;
        
        Citrato de SIMMONS (+):avaliar se consegue usar só o citrato como fonte de carbono, mudança da cor verde para o azul alcalinidade do meio, Salmonella utiliza citrato, é positivo;
        
        Motilidade (+): utiliza o ágar de motilidade, tem difusão do crescimento por todo o meio é positiva, Salmonella tem difusão;
        
        Malonato (-): Salmonella não metaboliza malonato, meio não muda de cor fica verde, se fosse positivo ficaria azul;
        
        Dulcitol (+): Salmonella fermenta o dulcifenol (positivo, pode ficar amarelo), produzindo gás ou não;
        
        Identificação Sorológica:
        
        Parte final, se faz pra identificar o gênero e depois para identificar o sorotipo quando for preciso, se é mesmo Salmonella e qual provável sorovar. Tem 3 antígenos normalmente, se testa o O e o H, outro é mais para Salmonella typhi (Vi) que não está muito presente nos alimentos;
        
        Soroaglutinação, pegar água destilada estéril, placa de vidro, pouco de cultura em cima da água destilada (a que tava no BHI) e pinga o soro pronto, mexe um pouco levemente, se ouve a formação de grumos, isso significa que é positiva para Salmonella para o antissoro;
        
        Identificação sorotípica (sorovar): Salmonella Typhimurium um pouco mais simples, contém mais tipos, tem uma parte da ISO só para sorovar. Se o antígeno O4 for positivo precisa testar O5. H1 e H2 se a reação positiva, nas duas, é uma typhi. Já Salmonella Enteritidis pertence ao grupo O9, próxima ao gallinarum, mais difícil, para diferenciar, gallinarum não é patógena para humano, O9 vê se aglutina, se a reação ainda for positiva, temos que testar com HE, HQ, HS, HS como controle negativo, não pode positivar. O46 é negativa para Enteritidis. Só para poucos tipos de alimentos que se faz sorovar.
        
        1° Pré- enriquecimento:
        
        Enriquecimento da diluição realizada, com a utilização de um meio em que as células injuriadas voltem a se multiplicar
        
        Incuba-se a amostra não seletivas a 35°C por 24h.
        
        Para a diluição da amostra posso usar água peptonada tamponada e caldo lactosado.
      - Contagem de Enterobacteriacea
        
        Segue a ISO 21528:2017 e se teve uma substituição da RDC pela RDC 331/2019, aonde coliformes termotolerantes foram substituídos pelos aerobios mesófilos, bolores e leveduras, enterobacteriaceae e E. coli.
        
        Enrobacteriaceae englobam Shigella, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Yersinia, Coliformes totais (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter) e E. coli.
        
        Semeadura em profundidade
        
        Faço a inoculação em duplicata em ágar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG). Homogenia em 8 e deixa solidificar.
        
        VRBG: é seletivo e diferencial para enrobactérias, sais de bile e cristal violeta vão promover a seletividade do meio de cultura. Dextrose fermenta as enterobactérias, vermelho neutro (indicador), peptona (fonte de C,N,H). Diluído e fervido no microondas, normalmente resfria a 45°C e utiliza para fazer o plaqueamento em profundidade.
        
        Quando estiver solidificado vou colocar uma sobrecamada de ágar em cima do ágar já solidificado, não precisa homogeneizar, só cobrir. Incubar invertidas por 24h a 37°C.
        
        Contagem das colônias: colônias são rosas ou vermelho mais escuro, podem ter esse alo mais claro ao redor delas por causa da precipitação da bile no meio de cultura, através da fermentação das enterobactérias, bastante tipo de E. coli esse comportamento.
        
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      - Análise de coliformes por NMP e E. coli:
        
        Segue a ISO 4831:2012
        
        Pensado principalmente para aqueles alimentos que teoricamente teria um número de coliformes menor, que é uma técnica bastante sensível, vai fornecer o número de microrganismo por unidade de volume de acordo com uma tabela estatística com base em probabilidade estatística onde um determinado número de coliformes vão estar presentes ali, dependendo da combinação de tubos positivos que tivermos na análise. Sendo que vão se usar meios líquidos e tubos de Durhan ( tubos pequenos de vidro que ficam dentro do tubo de ensaio).
        
        Etapa presuntiva: vamos inocular 1,0 ml de cada diluição, em cada um dos tubos, contendo tubo de durhan dentro
        (triplicata para cada diluição), com caldo LST. Incubar a 25°C por 24-48h. Tem como objetivo visualizar a formação de gás do tubo de Durhan e se teve turvação do LST.
        
        A partir do LST positivo com formação de gás vamos inocular uma alçada em caldo verde brilhante (VB) para visualizar os coliformes totais e outra alçada em EC para visualizar os coliformes termo tolerantes.
        
        Resultado para VB: podemos ter para uma diluição de 10-1, 3 tubos positivos para a formação de gás . Em 10-2, 2 tubos positivos e 10-3 temos 1 tubo positivo.
        Resultado para EC: podemos ter para uma diluição de 10-1, 3 tubos positivos para a formação de gás . Em 10-2, 1 tubo positivo e 10-3 nenhum tubo positivo.
        
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    - - Podem causar diversos tipos de doença, inclusive, produzir enterotoxina e causar doença transmitida por alimentos.
      - Plaqueamento em superfície
        
        A partir da diluição previa da amostra, será transferida para tubos contendo 9 ml de salina com 1 ml da diluição anterior, se faz a inoculação com 100 microlitros em placas de Baird Parker, contendo emulsão gema de ovo (função de tornar o meio diferencial, as cepas de Staphylococcus tem a capacidade de quebrar os lipídeos da gema e formam uma transparência) e telurito (forma coloração preta).
        
        Contudo, a primeira placa vou dividir 1 ml da primeira diluição da amostra ( que era 25g de amostra + 225 PEP) em 4 placas. 3 placas com 300 microlitros e 1 placa com 100 microlitros.
        
        As alíquotas adicionadas sobre a placa serão espalhar sobre a placa com alça de Drigalski. Incubar em 35-37°C por até 48h
        
        Após a incubação realizaremos a contagem das colônias típicas de Staphylococcus coagulase positiva, que consiste em colônias de centro preto com a formação de dois alos. Além das contagens, iremos tirar alguns isolados característicos para posterior analises bioquímicas.
        
        Essa colônia será estriada em ágar nutriente inclinado ou ágar TSA inclinado para posterior analise
        
        Coloração de gram:observar em microscópio, as colônias típicas possuem morfologia de cocos apresentando cor arroxeada em forma de cachos de uva.
        
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