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PCR - Coggle Diagram
PCR
¿Qué es ?
Amplificación in vitro de un fragmento de ADN especifico
Pasos
Preparación de la muestra
En un tubo para PCR se agregan los siguientes reactivos
ADN molde, los iniciadores, los nucleótidos o dNTPs, la solución amortiguadora , el cloruro de magnesio , el agua y la ADN polimerasa
Mezclar los componente de la reacción con un vórtex durante 2-3 segundos o dando unos golpecitos con el dedo o invirtiendo el tubo varias veces
Centrifugar brevemente para reunir la mezcla en el fondo del tubo
Amplificaión:
consiste en desnaturalización , alineamiento y amplificación
a. Desnaturalización inicial
Habitualmente la PCR utiliza un ciclo de desnaturalización . Se conseguirá elevando la temperatura del tubo de reacción hasta 94 grados por 30 segundo a 2 minutos
Se realizara ciclos desnaturalización alineamiento y extensión entre 25 a 35 veces
b. Alineamiento
Disminuir la temperatura de los incubadores entre 45 y 65 grados durante un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto
c. Extensión
Elevar la temperatura a 72 grados porque es la temperatura a la cual la Ta polimerasa alcanza su mayor actividad
Realizar una extensión final de aproximadamente 5 minutos a 72 grados para permitir que la polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos
Electroforesis
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Reactivos
Muestra de ADN que contenga la región o regiones que se desea amplificar , buffer o solución amortiguadora, cloruro de magnesio , desoxirribonucleótidos trifosfato, iniciadores , Taq polimerasa, agua destilada o desionizada estéril