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PREPARO DAS DILUIÇÕES BASE (DILUIÇÃO 1), SEMEADURA EM PLACAS, PREPARO DAS…

- - - - Realizar a inoculação dentro de 30 minutos após o preparo da diluição.
  - - - Pesar a amostra, pegando um pouco de todas as partes da embalagem
- - - - [...]
- - - - Resultados
- - - - Aguardar solidificação do meio
        
        Incubar as placas invertidas entre 35 e 38ºC por 48h.
      - Adicionar meio (ágar PCA) a 45ºC de modo a cobrir todo o fundo da placa
        
        Adicionar 1 mL da diluição na placa
    - - Faixa recomendada para contagem: entre 25 e 250 colônias
        
        Faz-se a média da contagem e multiplica-se pelo inverso do fator de diluição.
      - Exemplo de cálculo
        
        Diluição 10⁻²
        Contagem 1: 34 colônias
        Contagem 2: 48 colônias
        
        [(34+48)/2] x 10² = 4100 = 4,1 x 10³ UFC/g
- - - - Realizar espalhamento por toda a extensão da placa até que o meio absorva o líquido do inóculo
    - - Faz-se a média entre as contagens e multiplica-se pelo inverso da diluição e por 10, para levar em conta o volume 10x menor inoculado.
      - Exemplo de cálculo
        
        Diluição 10⁻³
        Contagem 1: 48 colônias
        Contagem 2: 53 colônias
        
        [(48+53)/2] x 10³ x 10= 505000 = 5,05 x 10⁵ UFC/g
- - - - 1mL da amostra em ágar PDA + ácido tartárico 10%
        
        O ácido tartárico reduz o pH, propiciando o desenvolvimento de fungos e inibindo o de bactérias.
        
        O ágar PDA (batata dextrose) estimula a produção de esporos em bolores e de pigmentos em alguns dermatófitos.
    - - Incubar as placas não invertidas a 25ºC de 3 a 5 dias
        
        Caso invertidas, as hifas e micélios entrariam em contato com a tampa, podendo até extravasar da placa
        
        CÁLCULOS
        
        Faixa recomendada para contagem: entre 15 e 150 colônias
        
        Exemplo de cálculo
        
        Diluição 10⁻³
        Contagem 1: 103 colônias
        Contagem 2: 87 colônias
        
        [(103+87)/2] x 10³ = 95000 = 9,5 x 10⁴ UFC/g
      - ágar DRBC
        
        Alimentos com aw > 0,95
        
        Retarda o crescimento de fungos que se proliferam rápido (Mucor, Rhizopus, etc.), permitindo detecção daqueles com taxa de crescimento menor.
      - ágar DG18
        
        Alimentos com aw < 0,95
        
        Para geleias, farinhas, etc. O dicloran controla o crescimento das colônias; glicerol 16% reduz a atividade de água e cloranfenicol inibe bactérias.
- - - - 0,1 mL da diluição sobre placa de ágar MYP; espalhamento com alça
        
        Incubar entre 30 e 32ºC de 24 a 48h.
        
        Colônias típicas: grandes e secas, com parte inferior rosa-avermelhada, cercadas por uma coroa precipitada claramente visível.
        
        Caso haja formação de colônias típicas, escolher 5 culturas para beta-hemólise
        
        Estriar em ágar sangue e incubar a 30ºC por 24h.
        
        B. cereus é beta-hemólise positivo, formando halos transparentes,
        
        CÁLCULOS
        
        Faixa de contagem recomendada: entre 10 e 100 colônias, preferencialmente menos de 30.
        
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        Exemplo de cálculo
        
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        Ágar diferencial composto por manitol, emulsão de gema de ovo e Polimixina B
        
        B. cereus forma colônias róseas, pois não consome manitol, rodeadas por um halo, pela hidrólise da lecitina. A polimixina B inibe crescimento de outras bactérias.
      - Testes Bioquímicos adicionais para confirmação
        
        Hidrólise do amido
        
        Realizar estria horizontal com cultura suspeita em ágar amido
        
        Incubar a 35ºC por 24h
        
        Adicionar solução de iodo/Lugol
        
        Resultado positivo para B. cereus: meio púrpura/azul com área incolor ao redor do crescimento (zona de hidrólise com formação de alfa-glicose)
        
        Hidrólise da gelatina
        
        Testa a capacidade de B. cereus em produzir a enzima gelatinase, hidrolisando a gelatina do meio
        
        Inocular a cultura em tubos com caldo nutriente de gelatina a 30ºC por 24h e refrigerar
        
        Caso haja solidificação da gelatina, resultado negativo; permanecendo líquida, positivo para B. cereus.
        
        Redução do nitrato
        
        Testa a capacidade de B. cereus em reduzir nitrato a nitrito através da nitrato redutase
        
        Adicionar nitrito + 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% + 3 gotas de ácido sulfanílico 0,8%
        
        Coloração rosa/avermelhada: resultado positivo para B. cereus
        
        Em caso negativo, adicionar zinco. Se não houver viragem de cor, resultado positivo.
        
        Teste de Voges-Proskauer
        
        Testa o consumo de glicose com produção de acetoína
        
        Adicionar reagente de Barritt em meio MR - VP inoculado com a bactéria
        
        VP positivo: aparecimento de coloração rosa/avermelhado.
        
        Fermentação da glicose em anaerobiose
        
        Inocular a colônia com gotas de óleo mineral em caldo vermelho de fenol com 1% de glicose
        
        Resultado positivo para B. cereus: aparecimento de coloração amarelo clara
        
        Motilidade
        
        Avalia crescimento rizoide
        
        Inocular uma placa de ágar nutriente com uma "picada" no centro. Incubar a 36ºC por 72h
        
        B. cereus não apresenta crescimento rizoide; é mais uniforme
        
        Resistência à lisozima
        
        Inocular tubo de caldo nutriente com 0,001% de lisozima
        
        B. cereus é resistente à lisozima
        
        Se houver turvação, resultado positivo para B. cereus
        
        Coloração de endosporos
        
        Realizar coloração de gram
        
        B. cereus produz endosporos
        
        Resultado: células vegetativas são gram + e endosporos se coram em verde
- - - - Semear em ágar nutriente a 37ºC por 24h
        
        Teste da oxidase
        
        Alçada de cultura crescida em ágar nutriente; passar para o disco de oxidase
        
        Esfregaço sobre a fita
        
        Resultado positivo para Enterobacteriaceae: desenvolvimento de coloração violeta/azul
        
        Teste de fermentação de glicose
        
        Inocular dois tubos contendo meio glicose OF com agulha de platina
        
        Tubo 1 - aerobiose: meio de cultura inoculado
        
        Resultado positivo para Enterobacteriaceae: coloração amarelada
        
        Tubo 2 - anaerobiose: meio de cultura inoculado + óleo mineral
        
        Resultado positivo para Enterobacteriaceae: coloração amarelada ou não fermentação (meio permanece esverdeado), como no caso de bactérias acéticas
    - - Faixa recomendada para contagem: entre 15 e 150 colônias
        
        Multiplica-se pelo inverso da diluição e pela porcentagem de colônias oxidase e fermentação positivas
      - Exemplo de cálculo
        
        Diluição 10⁻²
        Contagem 1: 138 colônias
        Contagem 2: 101 colônias
        3 das 5 colônias testadas para oxidase e fermentação foram positivas = 60%
        
        [(138+101)/2] x 10² x 0,6 = 7170 = 7,2 x 10³ UFC/g
- - - - Resultado positivo: formação de gás e turvação do meio
        
        A partir de uma amostra positiva, inocular uma alçada em caldo VB e outra em caldo EC
        
        Caldo VB: visualização de coliformes totais. Incubar entre 35±2°C ºC por 48h
        
        Observar se houve crescimento, comparar com valores previamente definidos pela tabela do Cálculo e resultado NMP e quantificar coliformes na amostra pelo valor mais provável
        
        Exemplo
        
        Houve turvação e formação de gás em três tubos de diluição 10⁻¹, um tubo de diluição 10⁻² e nenhum de diluição 10⁻³
        
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        Caldo EC: visualização de coliformes termotolerantes. Incubar entre 44,5±1°C por 48h
        
        A partir de EC positivo, realizar testes de confirmação de E. coli
        
        Com uma alçada de EC positivo, realizar esgotamento em ágar EMB
        
        Incubar a 37ºC entre 24 e 48h
        
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- - - - Realizar a contagem de colônias típicas: coloração preta no centro com formação de dois halos
        
        Limite máximo (RDC nº 12/2001, da ANVISA): 5,0 x 10³ UFC/g
      - Análise bioquímica
        
        Estriar colônia em ágar nutriente ou TSA
        
        Coloração de gram
        
        Observação de cocos de coloração roxa e morfologia de cachos de uva
        
        Teste da catalase
        
        Estriar colônia em uma lâmina e adicionar água oxigenada
        
        A formação de bolhas é indicativa de catalase positiva
        
        Teste da coagulase
        
        Passar uma alçada do inoculado em ágar inclinado para caldo BHI
        
        Incubar entre 35 e 37ºC de 18 a 24h
        
        Adicionar uma proporção 1:1 em tubos com plasma de coelho
        
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- - - - Permite crescimento de Salmonella e inibe microbiota acompanhante
      - 1 mL do cultivo + 10 mL de caldo TT
        
        Incubar a 35 ± 1ºC por 24h
        
        Inibe a multiplicação de coliformes; Proteus pode interferir na detecção de Salmonella
      - 0,1 mL do cultivo + 10 mL de caldo RV
        
        Incubar a 41,5 ± 1ºC por 24h
        
        Plaqueamento seletivo e diferencial Isolamento em meio BPLS ou XLD. Incubar a 35 ± 1ºC por 24h
        
        Selecionar colônias típicas, passar para ágar BHI, incubar a 35ºC por 24h e então realizar testes bioquímicos e sorológicos
        
        Triagem bioquímica
        
        Ágar TSI
        
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        Ágar LIA
        
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        Ágar UREIA
        
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        Série bioquímica
        
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        BPLS: Lactose e sacarose na composição. Vermelho de fenol como indicador de pH e bile, verde brilhante e novobiocina como inibidores
        
        Resultado positivo para Salmonella spp.: colônias de cor rosa rodeadas por zona vermelha
        
        Quando há formação de colônias amarelo esverdeado com coloração vermelha ao redor é indicativo de microrganismo fermentador de lactose e sacarose
        
        XLD: Possui lactose, sacarose e xilose na composição. Desoxicolato de sódio como inibidor.
        
        Resultado positivo para Salmonella spp.: Produzem H₂S, formando colônias escuras
        
        O verde de malaquita é bacteriostático e a alta temperatura inibe algumas bactérias