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FACS e RNA lezione 5, image, Un bravo analista dalla dimensione delle…
FACS e RNA lezione 5
FACS
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Uso di anticorpi marcati con proteine fluorescenti (es. Fluoresceina FITC di colore verde). Le cellule vengono fatte passare attraverso un capillare. Il laser colpisce le cellule e il detector se è presente il fluoroforo emette un segnale e fa variare il campo magnetico alla fine del capillare per separare le cellule che presentano fluoroforo dalle cellule che non lo presentano.
Esistono sistemi con più anticorpi e il sistema separa le cellule che possiedono un tipo da cellule che possiedono l'altro (colorazione verde e rossa per esempio).
Come metodo preparativo: permette di separare una popolazione mista per svolgere poi ulteriori analisi
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Applicazioni
Staining di citochine intracellulari: prima di tutto fissazione (es. con gliceraldeide) poi permeabilizzazione per permettere l'ingresso dell'Ab marcato e poi valutazione tramite FACS.
Analisi della proliferazione cellulare: si fa uno staining del DNA impiegando un reagente esterno. In base alla quantità di DNA si può stabilire se la cellula è in fase G1/S o M.
Analisi dell'apoptosi: si utilizza un reagente che lega l'annessina-5. Se è presente sulla superficie cellulare la cellula sta morendo per apoptosi.
Valutare la presenza di un antigene sulla superficie: questo è lo scopo per il quale il FACS viene maggiormente impiegato.
Target Validation
CRISPR/Cas
Questa tecnologia utilizza due elementi:
- Una guida a RNA che riconosce una sequenza specifica
- Un enzima CAS che grazie ad un legame con l'RNA si lega al DNA che codifica per il gene di interesse e taglia la sequenza
Protocollo:
- Analisi bioinformatica
- Sintesi dell'RNA guida (gRNA)
- introduzione separata di RNA guida ed enzima tramite elettroporazione, trasfezione lipidica (lipofezione) o con vettori virali (es. lentivirus)
- Controllo che il gene sia effettivamente rimosso con PCR o sequenziamento di Sanger
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Hanno il compito di verificare se il target selezionato per un farmaco è davvero il "responsabile" della patologia
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4 tipologie di tecniche principali:
- Generation antisense (old e new)
- Rybozyme
- New generation antisense
- RNA interference
Tecnologie antisenso per il DNA: sia la old che la new sono tecnologie obsolete. Consisteva nell'introdurre DNA o RNA a singolo filamento complementare al DNA o RNA della cellula perchè si accoppiassero inibendo la traduzione. Poca resa, aspecifica e molto costosa.
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RNA interference (RNAi)
Scoperta casuale, volevano modificare il colore di alcuni fiori
Meccanismo biochimico dell'RNAi:
- dsRNA, lunghi o corti (composto da 20-30 frammenti) introdotto nella cellula
- nella cellula DICER frammenta il dsRNA in tanti frammenti (short interfering RNAs, siRNA)
- RISC separa il doppio filamento formando il complesso RISC con 21 bp del singolo filamento
- il complesso si dirige sull'RNA target grazie al siRNA di nostra scelta
- RISC taglia l'mRNA e non viene prodotta proteina
A livello ribosomiale la presenza del siRNA induce un arresto traduzionale
Metodi per produrre i siRNA nella cellula:
- Chimico: sintesi chimica del siRNA ( Vantaggi: spediti dalla ditta, puri e costo basso, bisogna poi introdurli con lipofezione; Svantaggi : efficacia insufficiente se usati uno alla volta, si usano almeno due o tre sequenze per aumentare l'efficacia del knockdown)
- Trascrizione in vitro: sistema plasmidico con sui si ottengono tanti RNA
- Trascrizione in vitro seguita dal taglio delle RNasi
Trascrizione in vitro
- Si prendono due sequenze di DNA complementari e si inserisce un promoter T7 (sequenza che viene riconosciuta dalle DNA polimerasi)
- Annealing con due oligonucleotidi (per entrambe le sequenze)
- Il frammento Klenow dell'RNA pol riempie i buchi e si ottiene una sequenza di DNA a doppio filamento con il promoter
- La T7 polimerasi trascrive l'RNA senso e antisenso che vengono poi fatti ibridizzare.
- Dato che è stata ottenuta una molecola di RNA molto lunga si può digerire con RNasi specifiche ottenendo tanti piccoli siRNA da introdurre nella cellula
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Tipi di RNA
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Non- coding RNA: in particolare i miRNA sono implicati nella regolazione della trascrizione, sono considerate epigenetiche perchè non vanno ad intaccare il DNA.
Sono inoltre implicati nella difesa virale, regolazione post trascrizionale e mantenimento dell'integrità genomica
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FACS vs Western Blot
Esempio: ho tre popolazioni diverse con diversa espressione di un antigene:
- Popolazione 1: tutte le cellule esprimono allo stesso modo l'Ag
- Popolazione 2: 5 cellule su 11 ne esprimono tanto
- Popolazione 3: una cellula ne esprime moltissimo, le altre poco
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In questo caso (e di solito) utilizzo di un controllo negativo aspecifico che risulta di minore fluorescenza.
Un bravo analista dalla dimensione delle cellule e dalla granulosità del citoplasma è in grado di dire quali cellule siano in apoptosi, quali in fase ploriferativa e quali già morte
