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TRASCRITTOMICA studia l'insieme di mRNA di una cellula, 28S e 18S sono…
TRASCRITTOMICA studia l'insieme di mRNA di una cellula
Storia delle analisi dell'mRNA
Northern Blot
RNA Protection Assay (RPA)
PCR
PCR quantitative
Array
RNA sequencing (RNA Seq)
RT-PCR
Droplet digital PCR
Come ottenere un campione analizzabile
Isolare RNA da tessuto o linea cellulare
Trattamento con DNasi per evitare di amplificare DNA genomico
Utilizzo di una trascrittasi inversa per ottenere DNA complementare (cDNA)
Trattamento scelto
Il cDNA presenta:
un cap e una coda poli-T
NON contiene introni
non dimenticare lo splicing alternativo
Northern blotting
Fornisce un'informazione che le altre non forniscono: la lunghezza sei frammenti. Per questo è utilizzata ancora oggi
Analisi di mRNA marcati con sonde di 30-40 nt marcate con fluorescenza che vengono fatte correre su gel di acrilammide
Tipicamente si ha un esperimento e un controllo per valutare le differenze e l'avere un gene housekeeper di riferimento permette di normalizzare il dato
Tecnica quantitativa e qualitativa
RNAse Protection Assay
Tecnica poco utilizzata oggi, una volta era un'alternativa al Northern blot
Permette di identificare la presenza di un particolare mRNA di cui conosco la sequenza
Sonda che reagisce con mRNA in soluzione e protegge la sequenza a cui si appaia mentre la RNasi taglia il resto. Quindi ottengo frammenti di RNA di cui conosco la lunghezza (quella della sonda)
PCR
Cosa serve per fare una PCR:
DNA pol termostabile (es. Taq)
coppia di oligonucleotidi sintetici (primer)
desossinucleotidi trifosfati dNTPs
Cationi bivalenti (Mg2+)
Tampone, buffer
Cationi monovalenti
DNA stampo
3 fasi di un ciclo di PCR
1 Denaturazione: 94-95°C fortemente influenzata dal contenuto di GC, maggiore la percentuale, più difficoltosa la denaturazione
2 Annealing: fase cruciale, la temperatura deve essere attentamente calcolata, di solito 5-6° sotto la t di melting
Estensione: 72-78° circa
Regole da tenere a mente per la PCR:
primer tra 18-22 bp
primer con 50-60% di GC
t° di annealing 50-65° comunque non troppo bassa
primer senza lunghi tratti polinucleotidici
t° annealing primer forward = o simile al p. reverse
evitare tratti che possono dare self-annealing
Ogni 10 cicli abbiamo un'amplificazione di 1000 volte
Protocollo
Ottenimento del campione di interesse
Estrazione dell'RNA e
consigliabile trattamento con DNasi
Trasformazione dell'RNA in cDNA tramite l'utilizzo di una trascrittasi inversa
Svolgimento della PCR
Analisi dei risultati
Tipologie di priming per la trascrittasi inversa
Oligo (dT): 18 timine che si legano alla coda poli-A degli mRNA che la presentano, possiamo amplificare quindi poi soltanto gli mRNA
Random hexamer: misto di oligonucleotidi che rappresenta tutte le combinazioni possibili per quel numero di nt. Può legarsi ad un punto random della sequenza di RNA quindi crea cDNA di dimensione diversa e inoltre non è in grado di riconoscere l'mRNA.
Specific: un primer specifico che ci permette di amplificare un solo cDNA che può essere un vantaggio
Caratteristiche di un RNA di
buona qualità
(importante per fare una buona PCR)
Assorbanza 280-260nm (significa libero da proteine)
elettroforesi: rapporto bande 28S/18S è circa 2:1
non deve esserci DNA
non devono esserci inibitori della PCR
Controllo di presenza di artefatti:
Controllo positivo: assicurarmi il corretto funzionamento di primer ed enzimi soprattutto se sto cercando di dimostrare l'assenza di espressione di un gene
Controllo negativo: assicurarmi che primer ed enzimi non siano contaminati e di conseguenza mi mostrino templato dove non c'è
PCR classica
è un'analisi end-point: al termine dei cicli analizzo il prodotto con una corsa elettroforetica su gel di agarosio con DNA colorato con etidio bromuro. Ma questa quantità non è proporzionale a quella iniziale quindi a fini quantitativi è inutile
La corsa elettroforetica risulta utile anche dopo una RT-PCR per evidenziare la presenza di contaminazioni con DNA genomico (è sempre bene disegnare primer forward e reverse che circondano un introne)
Problemi di un'analisi end-point:
poca precisione
bassa sensibilità
bassa risoluzione
non automatica
discriminazione solo sulla dimensione
risultati non numerici
processamento post-PCR
il campione si analizza al
plateau
Real Time PCR
Vantaggi:
Misurazione ad ogni ciclo
Elevata precisione
Disponibilità immediata dei risultati
Possibilità di fare una quantizzazione relativa o assoluta
Costi tutto sommato contenuti
misurazione ad ogni ciclo della fase esponenziale, durante la quale la quantità di prodotto amplificato rimane proporzionale alla quantità di partenza. (fase esponenziale, lineare e plateau)
Metodi di misurazione dei prodotti:
Diretto e aspecifico come SYBR Green che si lega al doppio strand
Quando è intercalata la sua fluorescenza è 1000 volte maggiore di quando non è intercalata. L'apparecchiatura rileva la fluorescenza che è proporzionale alla quantità di DNA a doppio filamento. Essendo aspecifico si lega anche a trascritti sbagliati e primer dimers (primer legati tra loro)
Indiretto e specifico come la Taq-Man Probe
Sequenza di 40 basi complementare alla parte interna di cDNA. Alle estremità presenta un Reporter (emette fluorescenza) e dall'altro un Quencher (smorza il segnale se è vicino ad R). Dopo l'annealing si lega al DNA e viene poi demolita dalla polimerasi 5' esonucleasica. Q ed R si allontanano e la fluorescenza non è più smorzata. Non riconosce primer dimers nè trascritti sbagliati.
Altri due sistemi sonda
Molecular Beacon (faro in inglese): sonda con quencher e fluoroforo. La sonda ha un airpin luup con quencher e fluoroforo alle estremità che si ritrovano vicine. Quando la sonda è chiusa non abbiamo segnale. Quando si attacca all'RNA si apre il loop e il fluoroforo si distanzia dal quencher e il segnale è forte a questo punto.
Sonde scorpion (scorpion probe): hanno in più un pezzo attaccato al quencher che si lega alla sequenza (primer), dopo che sono state aggiunte le basi la sonda si apre e si distanziano quencher e fluoroforo.
Risultati di una RT-PCR
y: quantità di prodotto
x: numero di cicli
Ct (crossing treshold) o Cp (crossing point) è inversamente proporzionale alla quantità iniziale di prodotto.
Per conoscere la differenza di concentrazione di due campioni calcolo la differenza di Ct ed elevo 2 per quel valore.
Per analisi con un gene target di riferimento si utilizza la formula deldadeltraCt ossia: calcolo il deltaCt del controllo e dell'esperimento. Dopo di che sottraggo al delta Ct del test il delta Ct del controllo. Elevo 2 a quel valore. Il segno + o - serve per normalizzare se è più o meno espresso
Curva di melting
finita l'amplificazione l'apparecchiatura scalda i reagenti per rilevare a quale temperatura si dissocia il DNA (diminuzione della fluorescenza) e si ottiene una curva che viene analizzata
Se il grafico presenta due picchi significa che erano presenti due composti e non uno soltanto, potrebbero esserci primer dimers da verificare con corsa elettroforetica
Si fa con il SYBR Green e si fa per capire se c'è un prodotto solo (un solo picco) o più di uno (più picchi).
Quantizzazione
Quantizzazione relativa se si confrontano due situazioni diverse
Quantizzazione assoluta se devo confrontare rispetto alla quantità iniziale e allora mi serve una curva standard, una taratura
Droplet Digital PCR
Macchina con un sistema a ultrasuoni microfluidico abbastanza costoso
La macchina divide il volume di campione in moltissimi pozzetti di modo che in linea teorica si abbia una molecola per pozzetto. Segue l'amplificazione (30-35 cicli, è una end-point). Al termine la macchina conta i pozzetti positivi e negativi (vuoti) e tramite l'algoritmo statistico di Poisson ottengo l'informazione sulla quantità iniziale del prodotto
utilizzata nei kit per verificare la presenza di mutazioni in alcuni tipi tumorali
Ci sono 3 tipi di tumore al seno, uno di questi è causato da un malfunzionamento del canale EGFR ed è quindi possibile utilizzare un anticorpo monoclonale per bloccarne l'azione eccessiva (Trastuzumab). Se però la proteina G accoppiata al canale, Kras è mutata e quindi è sempre attiva il trattamento è inutile. Kras è mutata in moltissimi tumori ed è considerata un Undruggable target (forse sta cambiando qualcosa, 2021). Per valutarne la mutazione si utilizza la Droplet Digital PCR con due sonde beacon: una di controllo e l'altra che riconosce soltanto il WT. Non sarebbe possibile utilizzare questo sistema a due sonde con la RT PCR
Microarray
La prima applicazione è stata nel '95, si possono analizzare tutti gli mRNA contemporaneamente ma oggi è quasi completamente sostituita dall'RNA Seq
Questa tecnica si avvale di "chips" supporti sui quali troviamo sonde che riconoscono sequenze specifiche di cDNA preventivamente marcato (labelled). Dopo l'ibridizzazione il chip viene lavato e analizzato.
Sonde
Microarray con cDNA, più vecchio e meno efficiente, la lunghezza media è elevata e sono aspecifiche
Oligo Array, più efficiente dell'array con cDNA e la risposta è più specifica
Affymetrics chips, i più utilizzati oggi, realizzati con tecniche microlitografiche con oligo molto corti (20 basi circa) molto specifici
Marcatura
Doppia marcatura: si usava molto prima. Paragoniamo una cellula tumorale ad una di controllo con due fluorofori diversi e vediamo un quadro con competizione di DNA per le sonde.
Singola marcatura: con affymetrix e sistemi matematici
Limiti
alti costi
semi-quantitativa: adatta a screening sommari con molti geni. questo perchè avviene su un supporto e non in soluzione quindi c'è ingombro sterico e non è precisissima
semi-qualitativa: non individua mutazioni puntiformi
Nanostring
Meno potente del Micro Array perchè si può analizzare solo un migliaio di RNA vs decine di migliaia)
Utilizza una doppia ibridizzazione con una capture probe e una reporter probe. L'ibridizzazione avviene in
soluzione
per questo è più efficace del Microarray.
La capture probe lega il target al supporto mentre la reporter presenta una sequenza di fluorofori specifica (bar code) che viene riconosciuta dal sistema e possiamo così conoscere la quantità di un certo target. C'è anche un sistema che permette l'allineamento delle sonde nella maniera corretta per poter essere lette (forse magnetico).
28S e 18S sono rRNA
Quantizzazione relativa
Quantizzazione assoluta
