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PROTEOMICA
identificazione delle proteine e loro espressione
Classificazione della proteomica
Differenziale: studia l'espressione diversa nelle proteine in cellule diverse dello stesso organismo e nelle diverse fasi della vita della cellula e dell'organismo
Funzionale: studia l'interazione tra le proteine (interattomica) e tra proteina e substrato (metabolomica)
Sistematica: identificazione e caratterizzazione del proteoma
A cosa serve la proteomica?
Permette di vedere le mutazioni nelle proteine. Non sempre l'espressione dell'mRNA riflette i livelli di proteine trascritte. Le proteine hanno ruoli chiave nei fattori fisiologici e di conseguenza anche di quelli patologici. Conoscerle ci permette di sviluppare migliori tattiche terapeutiche e diagnostiche.
Come determino la sequenza amminoacidica di una proteina?
Metodo di Edman: utilizza il fenil isotiocianato che si lega al gruppo amminico dell'alfa amminoacido terminale. In presenza poi di acido trifluoroacetico che fornisce un ambiente debolmente acido si scinde il legame peptidico tra l'aa legato al fenil isotiocianato e il secondo aa. In questo modo otteniamo PTH- amminoacido che possiamo analizzare con HPLC per capire di quale si tratta. Si ripete il processo fino ad esaurimento della catena amminoacidica
Metodo di Sanger: uguale, cambia solo il reagente che è il cloruro di dansile.
Elettroforesi
Monodimensionale
Come l'SDS-Page: (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, ossia elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato) è una tecnica analitica che permette l'analisi di estratti proteici. Si possono utilizzare anticorpi chericonoscono le singole proteine
Bidimensionale
Tecnica selettiva preparatoria che consiste nel far correre il preparato prima in direzione orizzontale e poi verticale ottenendo vari spot. Utilizzata per separare miscele proteiche complesse. I principi più utilizzati per questo tipo di analisi sono il punto isoelettrico e il peso molecolare.
Limiti
affidabilità
rapidità di esecuzione
sensibilità
Limiti superati dall'introduzione della spettrometria di massa oggi tecnica d'elezione
è un metodo di separazione, in ogni banda o spot ho proteine dello stesso tipo che posso poi analizzare ulteriormente.
Proteomica: si basa essenzialmente su due differenti passaggi analitici consecutivi: la separazione delle proteine che costituiscono il proteoma e la loro successiva identificazione individuale
Cromatografia
Specialmente la cromatografia liquida utile come metodo analitico e come preparazione all'utilizzo della spettrometria di massa
Spettrometria di massa
Da cosa è costituito lo spettrometro di massa?
un sistema di introduzione del campione;
un sistema di produzione degli ioni corrispondenti alle molecole neutre introdotte (sorgente o ionizer);
uno o più sistemi di separazione, in funzione del rapporto massa/carica, degli ioni prodotti e di eventuali frammenti da essi generati (analizzatori di massa);
un rivelatore con relativa amplificazione dei segnali gestito da potenti sistemi informatici (detector)
Top-down
NO enzimi
Separazione delle proteine intatte per cromatografia
spettrometria di massa, anche in tandem e analisi dei dati
costoso e difficile da analizzare
Bottom-up
uso di enzimi digestivi come tripsina (idrolasi) prima dell'analisi cn spettrometro di massa
separazione delle proteine con elettroforesi bidimensionale e poi digestione enzimatica
Oppure: digestione enzimatica e poi separazione multidimensionale
ESI/MALDI spettrometria in tandem
ricerca nei database e identificazione proteica
più utilizzato, meno costoso, possibilità di analizzare le proteine de novo(?!). Non è adatta alla valutazione delle isoforme e delle modifiche post-traduzionali
Spettrometria in tandem (MS/MS)
Selezione di un singolo ione peptidico da uno spettro MS che viene frammentato per collisione con un gas inerte e ulteriormente analizzato con MS. La sequenza viene dedotta dalla diversa massa degli ioni ottenuti.
SILAC
stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture) è una tecnica basata sulla spettrometria di massa che mira a rivelare le differenze
quantitative
nella distribuzione di proteine tra più campioni utilizzando una etichettatura di tipo non radioattivo, che fa uso di marcatori come isotopi pesanti (es. marcatura con C12 e C13).
Protein Array (Chip) Technology
Simile al DNA Chip, si tratta di una reazione in fase solida. Ha il vantaggio di essere altamente miniaturizzabile e multiplexed, rapido,
automatizzabile, sensibile ed economico.
Più complesso del DNA Chip dato che le proteine si ripiegano e non rimangono lineari. è opportuno utilizzare degli "spacer" per tenere lontano la proteina dalla superficie ed evitare così che si venga a modificare la sua struttura terziaria falsando i risultati.
Tre approcci
Sistema a sandwich (tipo ELISA): sul supporto in plastica o vetro sono posizionati degli anticorpi che legheranno la proteina di interesse. Questa verrà riconosciuta e legata in un altra zona da un anticorpo marcato.
Antigen capture: meno utilizzato, si utilizza un solo anticorpo legato al Chip e la proteina marcata con fluoroforo
Approccio diretto: proteine depositate sul Chip che vengono riconosciute da un anticorpo marcato con fluoroforo
Come si può studiare l'interazione proteina-proteina?
Depositando una proteina sul Chip e facendo la reazione con un altra marcata con fluoroforo
Valutare l'attività delle chinasi: porre sul Chip diversi substrati e poi far reagire con chinasi in presenza di ATP (con P radioattivo).
Studiare piccole molecole: a causa delle loro dimensioni non possono essere marcate, quindi le leghiamo a BSA (bovine serum albumine) marcata con fluoroforo. Dopo di che di utilizza un approccio diretto.
Proteome Profiler Array
Sistema che utilizza streptavidina
Sistema di amplificazione con avidina-biotina e streptavidina: Si utilizza un aticorpo marcato con biotina e si aggiunge avidina (che può legare 4 biotine) e un enzima. L'avidina lega la biotina e si forma una struttura tridimensionale che amplifica il segnale per un solo anticorpo legato. La streptavidina ha elevata affinità per biotina e vi si lega.
Antibodies Barcoding
Abbiamo poche cellule e un sistema basato su Western Blot o protein chip non è abbastanza sensibile. Quindi per vedere variazioni di espressione della proteina di interesse utilizzo questo sistema.
Prendo anticorpi modificati con barcoding (sequenze di DNA) che dev'essere cleavable (tagliabile). Faccio avvenire la reazione, lavo e poi taglio la sequenza con un enzima dall'anticorpo (ogni anticorpo ha la sua sequenza particolare). Ottengo dei frammenti di barcode proporzionali alla quantità di anticorpi che si sono legati. Con un sistema nanostring o PCR a questo punto ottengo la quantizzazione.
Si possono fare analisi a single cell e si può aumentare ulteriormente la sensibilità svolgendo una quantitative PCR
La parte complessa di questa tecnologia è aggiungere la sequenza di barcoding al'anticorpo. Deve essere anche tagliabile quindi è una chimica sofisticata