Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
cyto- histo prac 1 - Coggle Diagram
cyto- histo prac 1
gentransfer en -expressie
doelstelling
bestudeergenen
optimaliseren cellen, in vivo gentherapie
expressie van genen
Janssens pharmaceutica
Galapagos (remedie tegen reuma)
meerwaarde expressie: post translationele modificaties, sulfide binding DIA 10
gentransfer in planten: AL tegen slangengif
transformatie: DNA binnenbrengen in gistcellen en bacteriën
transductie: DNA binnenbrengen in virussen
transfectie: DNA binnenbrengen in eukaryoten
basele kloneringsplasimde DIA 12
noodzakkelijke onderdelen voor constructie plasmide in prokaryoten
MCS: knipplaats restrictie enzym
ori: beginplaats replicatie
selectie: antbiotica resistentie
fig. p.8-11
expressieplasmide DIA 22
kloneringsvector: pUC
transportgen: geen expressie
fusie EW
2de gen: geen signaalsequentie
zelfde readingframe
1ste gen: geen codons
linker: extra AZ
2 EW domeinen zijn aan elkaar gehangen
promoter
constructief: komt direct tot expressie
induceerbaar
EW komt tot expressie na toevoegen inducer
tet systeem
OFF
inducer afwezig
DIA 26
ON
binding op operator
DIA 27
aangepast aan doelwitcel
SV 40 ori
extra regulerent element in eukaryoot
=> plasmide wordt vermenigvuldigd
rapporteergenstudies
doelstelling (4)
promotoractiviteit te testen
EW volgen
cel volgen
studie cellulaire mechanismen
promotor
gefusioneerd
aan C-terminaal : N-terminaal heeft sinaalsequentie voor celtransport
met reportergen
promotor of intrest + constitutieve promoter: interne controle = hoeveelheid promotor of intrest wordt er aangemaakt
Transfectie in eukaryoten
3 T's
transformatie
Binnenbrengen van DNA in bacteriën (of gisten)
Vb. elektroporatie, heat-shock
Ook voor planten met A. tumefaciens
transfectie
Binnenbrengen van DNA in eukaryote cellen
Vb. elektroporatie, lipofectamine, Ca3(PO4)2
transductie
Binnenbrengen van DNA via recombinante virussen
Vb. retrovirale vectoren, adenovirale vectoren
Transiënte transfectie
geen selectie voor positieve cellen
DNA bevindt zich
episomaal
geïntegreerd in het genoom
cellen verliezen expressie
Stabiele transfectie
selectie voor positieve cellen
Cellijn brengen transgen continu tot expressie
DNA steeds geïntegreerd in het genoom
selectiegen
Expressieplasmide
Apart selectieplasmide: cotransfectie
eukaryoten
Drug-resistentiegen
NeoR: resistentie tegen G418
PuroR: resistentie tegen puromycine
Resue-gen: HAT selectie (co-transfectie p.17)
Transfectietechnieken
biologisch (transductie)
virus als vehikel
vectoren
retrovirale
plant virale
adenovirale
chemisch
Calciumfosfaat
Liposoom-gemedieerd
fysisch
Elektroporatie
Micro-injectie
Magnetische beads
Gene gun
Laser-gebaseerd
Geslaagde transfectie in eukaryote cellen
DNA in cytoplasma
Transport naar kern!
Detectie van geproduceerd eiwit
afhankelijk van
Functionele eigenschappen
Specifieke info die men wenst te verkrijgen: mRNA detectie
Locatie waar het eiwit tot expressie komt
gesecreteerd
in cellysaat
in cel
raporteergen
zie tak rapporteergenstudies
promotorstudies
β-galactosidase
Colorimetrisch substraat: DIA 14
CPRG
ONPG
Luminogeen substraat: galacto-light
Histochemisch substraat: X-gal
Codon-optimalisatie