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TEST ELISA, ANTICORPI, PRINCIPALI APPLICAZIONI DEL TEST ELISA, ENZIMI E…
TEST ELISA
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SAGGIO INDIRETTO
Le piastre per microtitolazioni vengono rivestite di una preparazione di antigeni. Viene aggiunto il siero del paziente a diverse diluizioni e la miscela viene incubata per consentire agli anticorpi specifici di legare gli antigeni. Per rilevare la presenza dei complessi antigene-anticorpo viene poi aggiunto un secondo anticorpo. Questo secondo anticorpo è costituito da una preparazione di IgG anti-anticorpi umani, coniugati con l'enzima. L'attività enzimatica viene rilevata, in seguito all'aggiunta del substrato specifico, misurando l'intensità di una colorazione. Il colore ottenuto è proporzionale alla quantità del secondo anticorpo legato. Il legame del secondo anticorpo è l'indicazione che gli anticorpi presenti nel siero del paziente hanno riconosciuto gli antigeni presenti sulla piastra.
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ANTICORPI
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ANTICORPI MONOCLONALI
Sono prodotti da un clone cellulare (ibridoma) ottenuto per fusione di un linfocita B con una cellula di mieloma.
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ENZIMI E SUBSTRATI
Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell'avvenuto legame antigene-anticorpo consiste nella coniugazione dell'anticorpo secondario con una molecola che può essere direttamente rivelata. Gli anticorpi vengono coniugati a enzimi in grado di convertire un substrato incolore in un prodotto colorato.
Enzimi più utilizzati
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ALKALINE PHOSPHATASE: per gli anticorpi coniugati alla fosfatasi si usa in genere il substrato pnitrophenylphosphate (pNPP), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 405-410 nm.
Caratteristiche dei substrati: stabile, sicuro e non tossico, poco costoso, sia il substrato che il prodotto devono essere poco solubili