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DNA RECOMBINANTE, image, image - Coggle Diagram
DNA RECOMBINANTE
Biblioteca de DNA recombinante
Biblioteca Genômica (DNA genômico)
Envolve fragmentos de DNA de tamanho compatível com o vetor de clonagem
Ligação dos fragmentos ao vetor e introdução dos recombinantes na célula hospedeira
Biblioteca de cDNA (DNA complementar)
Utiliza transcriptase reversa
Possui 4 etapas:
1-Síntese in vitro de cDNA de fita dupla
2-Preparo dos cDNAs para ligação com vetor
3-Introdução dos cDNAs recombinantes nas células hospedeiras (amplificação)
4-Identificação dos clones por meio de triagem
CLONAGEM GÊNICA
Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas
Produz uma colônia que contêm milhares cópias do DNA recombinante
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO OU ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Enzima de restrição particular reconhece somente uma sequência única de bases
Fragmentos de diferentes organismos podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples
Os fragmentos poderão ser ligados permanentemente
DNA ligase promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição
Requer um grupo OH livre na 3' e um grupo fosfato na 5'
Tipos de fragmentos
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Vetores de clonagem do DNA
Apresentam certas características que tornam excelentes veículos de clonagem
Plasmídeos: Pequenas moléculas de DNA dupla fita, que apresentam elementos necessários para sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibióticos
Deve conter origem de replicação
Apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonuclease de restrição
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Após a infecção da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias:
Estado lítico
Estado lisogênico
Cosmídeo: muitos genes apresentam dimensões da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a técnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento é a chamada clonagem em cosmídeos
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São divididas em várias classes
As enzimas do tipo II são as mais importantes
Sequência palindrômica
Há 2 tipos de clivagem
Clivagem no eixo de simetria
Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria