Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Western Blot, 61030668 จิตรลดา มนต์อ่อน - Coggle Diagram
Western Blot
ขั้นตอนการทำwestern blot
- การทำเจลอิเลคโตรฟอเรซีส (gel electrophoresis)
- การย้ายโปรตีนจากเจลสู่แผ่นเมมเบรน (protein transfer)
- เตรียมโปรตีนจากการทำ electrophoresis
-
-
-
- เตรียมโปรตีนจากการทำ electrophoresis
ตัวอย่างที่จะนำมาใช้ในการทำ western blot อาจได้มาจากเนื้อเยื่อของเซลล์ หรือทำการสกัดโปรตีนออกมาจากเนื้อเยื่อออกมาทั้งหมด ซึ่งการขั้นตอนนการสกัดโปรตีนนั้นจะต้องมีการเติมสาร protease inhibitor ด้วยเป็นการป้องกันโปรตีนถูกย่อยสลายด้วยเอนไซม์ protease ที่มีอยู่ในเซลล์
- การทำเจลอิเลคโตรฟอเรซีส (gel electrophoresis)
เป็นการแยกโปรตีนตัวอย่างโดย อาจจะแยกตามค่า isoelectic point (pI) หรือแยกตามขนาดโปรตีน (molecular weight)เจลที่ใช้สำหรับการแยกโปรตีนส่วนใหญ่ใช้เจลอะคริลาไมค์ (acrylamide) ซึ่งในการแยกโปรตีนทำได้ทั้งแบบ native gel หรือ denature gel หรือที่เรียกว่า sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) SDS เป็นสาร ionic detergent ที่จะเข้าไปจับกับโปรตีนทำให้โปรตีนเกิดการเสียสภาพและกลายเป็นประจุลบ จึงทำให้การแยกโปรตีนด้วย SDS-PAGE จะเป็นการแยกตามขนาดโมเลกุล
- การย้ายโปรตีนจากเจลสู่แผ่นเมมเบรน (protein transfer)
เป็นการย้ายโปรตีนผ่านการแยกด้วยเจลอิเลคโตรฟอเรซีสแล้วย้ายสู่เมมเบรนที่มีประจุบวกเช่น nitrocellulose หรือ polyvinylidene fluoride (PVDF)
เป็นวิธีการป้องกันการเกิด non-specific โปรตีนอื่นๆเข้ามาจับกับแผ่นเมมเบรน หลังจากย้ายโปรตีนจากเจลสู่แผ่นเมมเบรนแล้ว โปรตีนจะจับอยู่กับเมมเบรน แต่ยังมีพื้นที่ของแผ่นเมมเบรนอยู่ที่โปรตีนไม่ได้เข้าจับ ดังนั้นเพื่อป้องกันการจับของโปรตีนตัวอื่นหรือแอนติบอดีกับแผ่นเมมเบรน จึงต้องทำการ blocking ด้วย bovine serum albumin (BSA) หรือ non-fat dry milk
ในขั้นตอนการติดตามผลนั้นจะมีการ probe เมมเบรนเพื่อหาโปรตีนที่สนใจด้วยแอนติบอดีซึ่งอาจมีการลิงค์ด้วยเอนไซม์ หรือสารเรืองแสงอื่น และเมื่อทำปริกิริยากับสารตั้งต้นจะทำให้มีสีเกิดขึ้นหรือมีการเปล่งแสงออกมา ซึ่งแบ่งเป็น two step detection และ one-step detection
Two-step detection เป็นการใช้แอนติบอดี เข้าไปจับโปรตีนที่มีความจำเพาะ เช่นใช้ 1o Ab จับโปรตีนที่สนใจ บ่มเอาไว้เพื่อให้เกิดการจับกันอย่างสมบูรณ์ หลังจากนั้นทำการล้างเพื่อชะ non-specific binding ออกไป แล้วจึงใช้ 2o Ab ที่ติดฉลากด้วยเอนไซม์ สารรังสี หรือสารอื่นๆที่สามารถติดตามการเกิดสีหรือเรืองแสงได้ ซึ่ง 2oAb จะเข้ากับกับ 1oAb อย่างจำเพาะ
One-step detection เป็นการใช้แอนติบอดีที่มีการติดฉลากด้วยเอนไซม์เรียบร้อยแล้ว ให้เข้าจับกับโปรตีนเป้าหมายได้และสามารถทำให้เกิดสีได้ทันทีหลังจากเติมสารตั้งต้น โดยไม่ต้องผ่านการใช้ 2o Ab เข้าจับอีกที
หลังจากทำการบ่มแผ่นเมมเบรนด้วยแอนติบอดีที่มีความจำเพาะแล้ว จากนั้นจะเป็นวิธีการติดตามว่าแอนติบอดีไปเกาะกับโปรตีนเป้าหมายที่ตำแหน่งใด ซึ่งการติดต่อวิเคราะห์ผลก็ขึ้นอยู่กับว่าแอนติบอดีที่ใช้ ติดฉลากด้วยสารอะไร แบ่งได้เป็น
-
-
-
-
Western blot หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า Immunoblot เป็นเทคนิคที่ใช้ติดตามโปรตีนที่สนใจในสารตัวอย่าง เช่น homogenate tissue หรือโปรตีนที่สกัดมา เป็นวีธีการคล้ายการทำ southern blot hybridization แต่เปลี่ยนจากการหาดีเอ็นเอที่มีความจำเพาะในตัวอย่างมาเป็นโปรตีนแทน ขบวนการในการทำ western blot ประกอบด้วย 6 ขั้นตอนหลักๆ
-