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A nociceptive neuronal ensemble in the dorsomedial prefrontal cortex…
A nociceptive neuronal ensemble in the dorsomedial prefrontal cortex underlies pain chronicity
刺激作用与micse，dmPFC（前额叶疼痛神经元）兴奋
长时间激活引发疼痛样行为，引发下游BLA（基地外侧杏仁核）和LPB（臂旁外侧核）兴奋
伤害反应区域标记
对反应区域的扫描
30 min/day在实验箱中适应，同时实验处理5 min，实验前3天
刺激时，接受4-6 W，5 ms刺激，间隔5 min做2 h
立即对大脑反应区域进行扫描
使用（DM-300, DIMEI, China）刺激后爪产生反应
刺激强度及位置可以改变，强度：5次刺激中有3次以上引起后爪抬起
4-6 W，5 ms
伤害神经元标记
病毒注射后2周恢复期
30 min/day在实验箱中适应，同时实验处理5 min，实验前3天。同时喂养40 mg/kg 阿霉素（Dox）食物
再喂养2天不含Dox的食物
刺激时，接受3 个刺激阶段（老鼠被分开4 h）
每个刺激阶段，老鼠接受（4-6W 5ms）激光在后爪进行1 h（5 min/次）
三个阶段后，老鼠被转回鼠笼，持续喂养1 g/kg Dox 食物过夜（阻断病毒表达）
之后老鼠40 mg / kg Dox食物持续到实验结束
背景神经元标记
除刺激阶段外，同
伤害神经元标记实验
进行相同处理（放置在相同实验盒中，1 h ，不接受激光刺激）
脑立体定位
坐标
dmPFC，前（AP） +1.65mm、左右（ML） ±0.3mm、深（DV）-1.65mm
AcbC（伏隔核）, AP +1.6 mm，ML ±1.2 mm， DV -3.55 mm
BLA，AP -1.6mm ， ML ±2.8 mm ，DV -3.8 mm
PAG（中脑导水管周围灰质
），AP -4.2 mm ，±0.3 mm ，DV -2.7 mm
LPB，AP -5.1 mm，ML ±1.3 mm ，DV -2.3 mm
1% 戊巴比妥钠（100 mg / kg）麻醉
在K+-磺酸盐细胞內液（含
K+ - Met-sulfonate (140.5 mM), NaCl (7.5 mM), (HEPES) 半钠盐 (10 mM), Mg-ATP (2 mM), and Na-GTP (0.2 mM), pH 7.33, 300–310 mOsm）填充时，阻力在5-8 MU
疑问：那个地方充满此溶液，？？？
光遗传与分析
脑立体定位，注射aav（AAV2/9-hSyn-GCaMP6s）病毒
4-6周恢复，实验前三天提前适应
给与机械刺激（大头针或毛刷）
给与热刺激（DM-300, DIMEI, China）
给与厌恶刺激（气球吹气）
matlab分析
GCaMP6s信号被光度测定系统记录（INPER,China）
微型双光子钙成像与分析
脑立体地位，注射aav（AAV2/9-hSyn-GCaMP6s）病毒
3-4周恢复
将微型双光子钙成像（FHIRMTPM V2.0,）插入目标脑区
图像由软件（GINKGO-MTPM, Transcend Vivoscope Biotech Co）获取
老鼠安置在透明盒（10cm×10×15）中，可自由移动
第一次记录前3天每天10min适应
记录，CFA注射后的第0，1，3，9天数据（10帧/s）
运动矫正，配对，细胞检测，信号提前由Suite2p进行
3种刺激，10次，30s间隔
疑问：怎么对大脑进行的扫描？
免疫组织染色
荧光激活细胞分选
颈椎脱臼处死，获取脑
在冰上将dmPFC和脑基质分离
机械粉碎在DMEM/F12培养基上
木瓜蛋白酶（1 mg/ml）37℃下培养30 min
组织碎片通过温和研磨形成单细胞
细胞通过70 μm 细胞滤器（F613462, BBI)）
再使用荧光激活细胞分选（BD Biosciences）进行目标单细胞（带有高 mCherry荧光信号）筛选
细胞被收集在含有核糖核酸酶抑制剂和裂解成分的试管中，为rna-seq分析做准备
细胞计数
疑问：使用什么进行的研磨？
rna-seq分析
原始数据处理，数据质控（包括Q30数据统计、数据质量统计、碱基数量统计等）
基因注释文件从UCSC 下载，并使用Bowtie2 构建索引文库
实验测序数据 标记到索引文库上，通过 TopHat
HTseq对标记上的基因进行 计数 ， 使用RPKM 进行表达质控
使用DESeq2 进行数量统计学计算，
g:Profiler 进行GO注射富集分析
Benjamin-hochberg 显示 p 值 低于 0.05 或改变2倍多，则认识差异表达基因
化学遗传
氯氮平-N-氧化物（CNO; Tocris, UK）溶置DMSO中至（20 mg/ml）
在溶置生理盐水中至0.2 mg/ml
注入dmPFC标记神经元（1 mg/kg ，i.p（腹腔注射）） ，记录30 min 行为
同样处理注入 含1 % DMSO的生理盐水 做对照组
脑片电生理
颈椎脱臼处死，剥离脑组织，
泡入冰，（95% 氧，5% CO2），KCl（2.5 mM），NaH2PO4（1.25 mM），CaCl2（0.5 mM）,MgSO4（10 mM），NaHCO3（26 mM），葡萄糖（10 mM），蔗糖（230 mM），pH 7.4 ,300-310 mOsm的溶液中
使用徕卡VT1000S切片机，切dmPFC 区域（厚 250 μm）
转入，（95% 氧，5% CO2），32℃，人工脑脊液（ACSF）溶液
（另含有：NaCl (126 mM), KCl (2.5 mM), MgCl2 (1.3 mM), NaH2PO4 (1.2 mM), CaCl2
(2.4 mM), NaHCO3 (18 mM), and 葡萄糖 (10 mM), pH 7.4, 290–300 mOsm. ）
切片在室温下温育 1h
之后，单个切片被浸没在记录盒中，同时继续被灌注（2 ml/min ，含 ACSF）
记录盒被放置在奥林巴斯BX51显微镜（带有 视频增强型红外差干扰）下，进而获得dmPFC中荧光激活细胞
使用 PC - 10拉拔器（(Narishige, Japan）将薄壁硼硅毛细管（Sutter, USA）拉成 贴片移液器
使用 Multiclamp 700B 放大器和 Clampex 10.6（Molecular Devices，美国）控制的 Digidata 1440A 接口 记录数据
信号在10 kHz 下记录，并滤去低于5 kHz
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dmPFC 慢性痛 万有