Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

TÈCNIQUES D'HIBRIDACIÓ - Coggle Diagram

- - - - MICROARRAYS
        
        Conjunt o coleccions de fragments d'ADN (sondes) diferents fixats a una superfície sòlida de vidre, plàstic o silici.
        
        Es realitza una sola hibridació i un microarray detecta simultàniament milers de seq. diferents, qualitativa i quantitativa
        
        PROTOCOL
        
        Marcatge de la mostra amb un fluorocrom
        
        Hibridació i rentat de posthibridació
        
        Lectura del microarray amb un escàner que disposa d'un làser que excita cada punt de la matriu
        
        Anàlisi i interpretació dels resultats amb un software específic
        
        Aplicacions
        
        Hibridació genòmica comparada en arrays (aCGH)
        
        Estudis d'expresió gènica
        
        polimorfismes i mutacions, detecció de microorgnismes, gens de fusió, l'estudi del splicing anternatiu d'ARN, etc.
    - - Dot Blot
        
        hibridació que usa membranes de nitrocel·lulosa o nailon com a suport sòlid.
        Permet la detecció de seq. d'AN dins mescla complexa
        
        PROTOCOL
        
        Aplicació de la mostra al suport
        
        Humectar membrana, eixugar i ensamblar un sistema de buid (diferent depenent de l'AN)
        
        Prehibridació
        
        Incubar membranes amb solució de prehibridació per evitar unions inespecífiques sonda-membrna
        
        Hibridació
        
        sustituir líquid prehibridació per volum igual de solució fresca amb la sonda
        
        Rentat de poshibridació
        
        2 o 3 rentats amb solucions que augmentin condicions d'alta rigurositat. Es fan a una cubeta
        
        Detecció de l'híbrid
        
        Sonda amb marcatge radiactiu: exposició autorradiogràfica
        Sonda amb marcatge amb haptens: mètode detecció cromogènic
        
        Rehibridació
        
        possible amb sondes amb marcatge radiactiu.
        Desnaturalitzar híbrids formats i eliminar 1º sonda usada.
        Rentar i reiniciar potocol
        
        APLICACIONS
        
        Com a tècnica de seguiment
        
        Estudis d'expressió gència;
        Detecció seq. estranyes en mostres biològiques;
        Control qualitat PCR;
        Control qualitat marcatge de sondes;
        Determinació del sexe en espècies sense diferència fenotípica
        
        Aplicacions específiques
        
        ASO dot blot
        
        Dot Blot inves
        
        Hibridació de colònies
        
        Hibridació de plaques virals
        
        incubar seqüencialment les membranes amb reactius per inmersió
      - Southern Blot
        
        permet identificar fragments d'ADN separats per elecroforesi en gel transferits a un membrana de nitrocel·lulosa o nilon
        
        PROTOCOL
        
        Digestió enzimàtica
        
        1 o + enzims de restricció
        Troçetjar l'ADN de partida en ragments de diferent mida
        
        Electroforesi en gel
        
        Per separar fragments
        En gel d'agarosa o poliacrilamida
        
        transferència de l'ADN a la membrana
        
        S'obté rèplica exacta del patró de bandes d'ADN en el gel sobre una membrana de nitocel·lulosa o nailon..
        Les passes inclouen: desnaturalizació, transferència (capil·laritat) i anclatge de l'ADN a la membrana
        
        Hibridació
        
        Similar a dot blot
        
        Revelat
        
        Autorradioagrafia amb pel·lícula de rajos X
        
        Aplicacions: Elaboració taques genètiques; estudi de mutacins estructurals i detecció de seq. adquirides.
      - Northern Blot
        
        Tècnica que permet detectar molècules d'ARN separades per electroforesi en gel i transferides a una membrana de nitrocel·lulosa o nailon.
        
        PROTOCOL
        
        similar Southhern, 3 diferències
        
        No digestió enzimàtica prèvia
        
        Elelctroforesi en condicions desnaturalitzants
        
        Innecessari desnaturalització abans de la transferència dl gel a la membrana
        
        Aplicacions
        
        Anàlisis d'expresió gènica
        
        Detecció de mutacions
        
        Estudis de tall i splicng alternatius
- - - - Formació d'híbrids ARN/ADN que seran reconeguts o captuats per anticossos específics
      - Si seq. diana és ADN - sonda ARN
        Si seq. diana és ARN - sonda ADN
      - PROTOCOL
        
        Lisi dels virus i desnaturalització de l'ADN amb una solució salina
        
        Hibridació de la mostra desnaturalitzada i la sonda
        
        Captura de l'híbrid (parets pouets recoberts d'anticossos anti-ARN/ADN
        
        Detecció de l'híbrid afegint anticossos anti-ARN/ADN marcats amb fosfatasa alcalina
        
        Revelat afegint sustrat quimioluminiscent
      - Tècnica desenvolupada per la detecció de múltiples agents infecciosos
    - - Sistema d'amplificació de senyal basat en la unió de la seq. diana a un macrocomplex d'ADN mitjançant successives hibridacions
      - PROTOCOL
        
        Lisi de les partícules víriques i desnaturalització
        
        Hibridació amb sondes específiques
        
        Per captura
        
        Per extensió
        
        Captura de l'híbrid-oligo. captura + soda captura
        
        Preamplificació - oligon. preamplificació + sonda extensió
        
        Amplificació - oligon. amplificació + oligon preampl.
        
        Detecció - oligon. marcats amb fosfatasa alcalina + oligon. amplif
        
        Revelat - substrat quimioluminiscent
      - tècnica que augmenta la sensibilitat de la tècnica de cptura de l'híbrid i a més permet la quantificació dels virus detectats
- - - - La hibridació in situ fluorescent es basa en l'us de sondes marcades amb fluorocroms
      - Aplicacions
        
        alteracions cromosòmiques (numèriques i estructurals= en relació amb el diagnòstic y pronòstic de patologies oncològiques o amb base genètica
      - PROTOCOL
        
        Hibridació directament sobre la preparació
        
        Rentat de posthibridció per inmersió dins una solució de rentat
        
        Contratinció - eliminar excés solució de rentat i afegir solució contratinció
        
        Visualització amb microscopi de fluorescència
      - FISH interfàsica i FISH metafàsica
        
        depenent de la FISH i del mètode emprat, s'utilitzen un tipus de sondes o altres, a més de que la interpretació dels resultats també difereix
    - - A la hibridació in situ cromogènica l'híbrid es detecta mitjançant una reacció inmunohistoquímica que produeix un producte colorat
      - Es realitza principalment sobre seccions de teixit FFPE
      - Aplicacions
        
        Detecció seq. gèniques de virus oncològics
        
        Detecció d'ARNm de les cadene K i Y de es Ig
        
        Estudis d¡expresió gènica mitjançant detecció d'ARNm concrets
      - PROTOCOL
        
        Desparafinització per inmersió en dsolvents orgànics
        
        Digstió enzimàtica amb proteinasa K i pepsina
        
        Prehibridació per bloquejar possibles unions inespecífiques
        
        Hibridació
        
        Rentat de poshibridació
        
        Detecció de l'híbrid
        
        Contratinció
        
        visualització