Mekanisme kerja dari streptomisin telah dipelajari jauh sebelum ditemukannya aminoglikosida yang lain seperti kanamisin, neomisin, gentamisin, tobramisin, amikasin, dan sebagainya, namun diduga bahwa semua antibiotik ini mempunyai mekanisme kerja yang sama. Tahap awal adalah perlekatan aminoglikosida pada reseptor protein spesifik yaitu subunit 30S pada ribosom bakteri dan selanjutnya aminoglikosida akan menghambat aktivitas kompleks inisiasi dari pembentukan peptida (mRNA + “formyl methionine” + tRNA). Kemudian pesan mRNA akan dibaca salah oleh “regiopengenal” pada ribosom, sehingga terjadi insersi asam amino yang salah pada peptida yang menghasilkan protein nonfungsional. Sebagai akibat terakhir perlekatan aminoglikosida akan menghasilkan pecahnya polisom menjadi monosom yang tidak mampu mensintesis protein