Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
HIBRIDACIÓ D'ÀCIDS NUCLEICS, Screenshot_20221207-121220_Samsung Notes …
HIBRIDACIÓ D'ÀCIDS NUCLEICS
CONCEPTES BÀSICS
HIBRIDACIÓ: molècula ss + molècula ss = molècula ds híbrida
SEQÜÈNCIA DIANA: Seq. conceta de BN que es vol detectar
SONDA: seq. BN complementària a la diana
BASES TEÒRIQUES DE LA HIBRIDACIO
DESNATURALITZACI'O
Ruptura ponts d'H entre BN d'una molecula d'ADNds
corva de fussió de l'ADN mesurant absorbancia a 260nm
Zona 1 --> valor basal d'absorbància desnaturalitzat 50%
Zona 2 -- efecte hipercròmic desnaturalitzat 100%
zona 3 -- desnaturalizat al 100%
Temperatura de fussió (Tm)
<500 pb : Augmenta la Tm segons la longitut de la molècula
500pb: a major percentatge de C-G,major Tm
RENATURALITZACI'O
2 molècules ADN separades es reassocien de nou fins a tornar formar la doble hèlix
Cinètica de renaturalització
major concentració, major velocitat de renaturalització
2 fases
fase de nucleació (lenta)
fase de tancament de cremallera (ràpida)
corves de renaturalització
de genomes procariotes
a major complexitat del genoma, menor velocitat de reacció
corves sigmoides
de genomes eucariotes
Seqüències altament repetides
major velocitat de renaturalització
corves sigmoides escalonades
Seqüències moderadament repetides
velocitat de renaturlització intermitja
Seqüències úniques
velocitat de renaturalització lenta
HIBRIDACI'O
factors que influeixen
força iònica de la solució
quanta més [ ] de cations monovalents, més Tm neessitam
Agents desnaturalitzants (formamida)
quanta més [ ] d'aquests agents, més Tm
Missmatch
Quantes més BN no complementàries, menor Tm
TIPUS I CARACTERÍSTIQUES DE SONDES
CARACTERÍSTIQUES GENERALS
Especificitat
capacitat que té la sonda per discriminar la seq. diana
Sensibilitat
probabilitat de detectar quantitats mínimes de l'hñibrid sonda-diana
sondes d'ADN
d'ADN recombinnat
PCR
de síntesis química
sondes d'ARN
de síntesis química
trascripció
sondes químiques sintètiques d¡AN
d`AN blquejats
d'AN peptídics
MARCATGE DE SONDES
PURIFICACIÓ DE LA SONDA MARCADA
cromatografia d'exclusióper mida
cromatografiad'adsorió
TIPUS DE MARCADORS
fluorocroms
haptens
isòtops radiactius
MÈTODES DE MARCATGE
desplaçament de tall
marcatge terminal
marcatge per sondes d'ARN
cebador a atzarr o aleatori
marcatge per PCR
FASES DE LA HIBRIDACIÓ
fase de prehibridació
preparació de la mostra
fase d'hibridació
necessitem temperatura òptima i que es realitzi en condicions relaxades
rentat de posthibridació
condicions d'elevada rigurositat o de rigurositat relaxada depenent de les necessitats
fase de detecció del híbrid
marcatge radiactiu, fluorocroms, haptens