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拿取蛋白質分析, 決定蛋白質一級結構, 2-D gels - Coggle Diagram
拿取蛋白質分析
Break down and take protein from cell
blender
potter-el
和離心機一起
超音波
不斷結凍溶化
detergent
獲取protein
鹽析
硫酸銨和蛋白質的水作用,讓疏水端露出,並凝集
先加入40%上清液丟棄
再用60-70%得欲取物
column chromatography
原理
物質在固定相流動相結合率不同
固定相裝於管住
率出速度和與固定相親和力大小有關
不同種類的層析
size-exclusion
固定相交錯鍵結的球形凝膠,分子量大先流出
製造孔洞
醣類混合物:dextran(sephadex) agarose(sepharose)
聚丙烯西安
affinity
樹脂上接有專一性的ligand,分析物流過和它結合,其餘流出,再用高濃度的ligand搶出蛋白質
ion exchange
陽離子交換:本身帶負電,吸引正電
陰離子交換:本身帶正電,吸引負電
分析蛋白質
電泳
帶電粒子在電場中往相反電位移動,移動率和charge shape size有關
polymer of agarose(核酸) and polyacrylamide(protein)為界質
對於蛋白質我們常用
SDS-PAGE
將蛋白質變性成負電,移動和分子量有關
native-PAGE
和charge weight有關
PI值可以控制蛋白質帶正電或負電
等電焦集(IEF.isoelectric focusing)
依蛋白質有不同PI值,調配PH值溶液,當達到PI值時,蛋白質會不帶charge並停住
決定蛋白質一級結構
方法步驟
用Edamn degration
6N HCL 100度 24hr
變成一顆顆胺基酸
用HPLC分析蛋白質含量
加入適當反應劑,識別N C端
在特定肽鍵修剪AA
酶
chymotrypsin
切有芳香環的 Tyr Phe Trp
Trypsi胰蛋白酶
切-C帶正電 Lys Agr
CNBr
切蛋白質中硫的位置
知道胺基酸存在、比率
計算有幾條胺基酸:決定N 、C端
決定小殘基的序列
2-D gels
SDS+IEF
電泳出的結果將其染色,可分辨具相同PI值但分子量不同的蛋白質